anti-hcd40sirna基因转染细胞株的建立.docVIP

CD40基因沉默对脑胶质瘤细胞株 U87生物学功能的影响 蔡文治 指导教师 居颂光 摘要：脑胶质瘤是神经外科中最常见的恶性肿瘤，发病率约占颅内肿瘤的45％左右。目前常规的治疗方法是最大限度地进行手术切除，并结合放、化疗和其他治疗方式。但由于胶质瘤存在恶性增殖和侵袭性强的特点，手术很难完全切除，且术后极易复发，而放、化疗药物攻击的靶点缺乏胶质瘤细胞的特异性，对正常脑组织功能和患者整体的免疫力造成极大损伤，患者的中位生存期仅12-15 个月[1]。这主要与脑胶质瘤微血管丰富、肿瘤侵袭性生长密切相关，因而，如何控制胶质瘤的恶性增殖和侵袭性生长是目前研究的焦点。 关键词：CD40　 RNA干扰　增殖　迁移　 我们的研究发现, 脑胶质瘤组织中CD40的过度激活及表达，可能与肿瘤的血管生成、侵袭性生长等生物学特性有关[2]。CD40分子可能成为脑胶质瘤治疗新的靶点，肿瘤治疗带来新的希望。为了进一步研究CD40分子在脑胶质瘤中表达的意义，本研究采用RNA干扰技术，沉默CD40分子，比较基因沉默前后肿瘤细胞的生物学行为改变，探讨CD40信号的分子机制。RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因沉默。是指外源或内源性的双链RNA进入细胞后引起与其同源的.RNA特异性降解，因而抑制相应基因表达，表现出特定基因缺失表现的现象。本实验参考RNAi序列设计原则并结合相关文献[3]，针对CD40基因的个设计1 对小干扰RNA(siRNA)和随机control siRNA，用带有强启动子polIII的质粒pSilencer 3.0-neo 构建CD40 siRNA和control siRNA表达载体,转导人脑胶质瘤细胞U87MG，在细胞内通过产生带有发夹结构的双链RNA，干扰CD40基因的过度表达。 一．试剂与材料 1.1 试剂 RNAi相关试剂：真核表达载体pSilencer3.1-H1 neo由美国Pittsburgh大学免疫学系Danial Johnson教授惠赠，克隆用大肠杆菌DH5α由苏州大学附属第一医院中心实验室国风教授惠赠。限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ，T4 DNA 连接酶，RT-PCR 试剂盒均为大连TaKara 生物公司产品，DNA Ladder 2000、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均购自日本TaKaRa公司。 抗体：FITC标记鼠抗人CD40单克隆抗体（eBioscience, 美国，克隆号：5C3）；PE/FITC标记鼠抗人IgG抗体(Immunotech, 法国)。 Western Blot试剂：细胞裂解液（Cell signaling, 美国）；蛋白酶抑制剂（Cell signaling, 美国）；Tween-20、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵（APS）等（Sigma, 美国）；丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate, SDS）、硝酸纤维素膜（Amersham, 美国）；碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG（SantaCruz, 美国）；蛋白marker (Fermatas， 美国) RT-PCR试剂：DEPC、Trizol (Gibco，美国)、Random primer和Reverse Transcriptase、DNA marker (Takela， 日本) 1.2 细胞株：胶质瘤细胞株U87MG来自ATCC，于含10%FCS的DMEM培养基中，37℃、5% CO2培养箱培养。 1.3 实验仪器：各种细胞培养板为美国Costar公司产品。CO2培养箱、离心机（Jouan, 法国）；细胞计数板；倒置显微镜（Olympus，美国）；流式细胞仪（Beckman Coulter, 美国）。 二．方法 2.1 SiRNA载体法特异性沉默CD40 基因稳定细胞株的建立 2.1.1 　发卡样CD40基因siRNA 的设计与合成 根据GenBank 中报道的CD40的核苷酸序列(GenBank accession no. X60592.1)，参考siRNA的设计策略，扫描CD40基因ORF序列中的AA序列，记录每个AA的3’端19个氨基酸作为潜在的siRNA靶位点。计算靶位点的GC含量，选择GC含量在30％～50％的序列作为候选位点。通过基因Blast和文献报道，设计干扰长度为19个碱基的特异性寡核苷酸序列：5’GCGAAUUCCUAGACACCUG-3’(192-212)，（图1）合成其发卡样两端配对siRNA 寡核苷酸链，同时合成互补链，分别在5’′和3’′端引入HindIII和BamHⅠ酶切位点(由美国Integrated DNA Technologies Inc.公司合成) 。（图2） 引物序列： shRNA-CD40 5’-GAT CCG CGA ATT CCT AGA