高病原性家禽流行性感冒检验方法.docVIP

高病原性家禽流行性感冒檢驗方法 壹、前言 高病原性家禽流行性感冒（Highly pathogenic avian influenza，以下簡稱HPAI）過去稱為「雞瘟」，是由正黏液病毒科（Orthomyxoviridae）之A型流行性感冒病毒感染所引起。A型流行性感冒病毒是唯一會自然感染禽鳥類的正黏液病毒。許多禽鳥類對家禽流行性感冒（以下簡稱為AI）病毒具有感受性。水禽為保毒宿主，而水禽帶原病毒對雞及火雞大多為低病原性。病毒之核蛋白衣（Nucleocapsid，以下簡稱為NP）和基質蛋白（Matrix proteins，以下簡稱為MP）為流行性感冒病毒型別相關抗原，血球凝集素（Hemagglutinin，以下簡稱H）及神經胺酸酶（Neuraminidase，以下簡稱N）為亞型（Subtypes）分類抗原。目前有16種H亞型（H1～H16）及9種N亞型（N1～N9）。只有H5和H 7兩 種亞型病毒會對雞、火雞及其他經濟類禽鳥造成HPAI臨床症狀。大部分H5和H7亞型病毒對家禽為低毒力。H5或H7病毒都可能突變成高毒力，因此，世界動物衛生組織（OIE）規範所有H5和H7病毒為須通報的家禽流行性感冒（Notifiable avian influenza；NAI）。 HPAI感染會依禽鳥的品種及年齡、病毒株的特性及環境因子，而呈現不同的臨床症狀。高感受性鳥類可能呈現無臨床症狀而猝死或呈現不一嚴重度之臨床症狀，例如結膜炎、鼻炎、咳嗽、噴嚏、呼吸困難、顏面腫脹、沉鬱、警覺性降低、顯著減少飲水及攝食、雞冠、肉垂及腳鱗皮膚發紺、神經症狀及下痢等。產蛋雞會有明顯的產蛋量下降，品質不良蛋增加。典型的HPAI常呈現高發病率及急速上升之死亡率。低病原性家禽流行性感冒（Low pathogenic avian influenza，以下簡稱LPAI）通常只造成輕微或無臨床症狀，但在某些情況下會產生嚴重的臨床症狀而誤以為是HPAI。 HPAI之確診係依據所分離出病毒之病原性鑑定，但在特殊情況下，可分析檢體中病毒血球凝集蛋白（以下簡稱為HA0）切割位之胺基酸序列，以達到確診的目的。檢測疑患禽鳥的血清抗體可做為輔助診斷，不適合用於確診。當有疫情發生時，為了防疫需求以儘速控制疾病，診斷可以依分子檢測結果（例如HA0切割位之胺基酸序列呈現HPAI病毒特徵），加上H亞型檢測的結果來判定。 病原性的鑑定係以接種無特殊病原（Specific pathogen free，以下簡稱SPF）或家禽流行性感冒（以下簡稱AI）抗體陰性（Specific antibody negative，以下簡稱SAN）雞隻的靜脈接種致病指數（Intravenous pathogenicity index，以下簡稱IVPI）或接種雞隻死亡率為其黃金準則。IVPI大於1.2或接種雞隻死亡率大於75%者判定為HPAI，IVPI低於1.2之H5及H7亞型須進一步分析其HA0切割位胺基酸序列，若HA0切割位的胺基酸序列與其他HPAI分離株的序列相似者，須考慮該病毒具有發展成HPAI的潛勢，爰判定為HPAI。 貳、實驗室檢驗 一、 病毒檢驗 (一) 採取病材 １、 病材採取之品質好壞及其保存與輸送的狀況，密切影響AI病毒之分離及診斷結果。採樣以發生臨床症狀三日內所得之病材檢測效果最佳。 ２、 死禽：死禽採取全身各組織臟器，包括氣管、肺、腸、脾、胰、腎、腦、肝及心臟等，病材可分開或混合處理。 ３、 活禽：活禽採取喉頭氣管拭子和共泄腔拭子，幼小個體禽類不易採集者，則採新鮮排遺取代之。採取之拭子保存於含有抗生素的磷酸緩衝液（Phosphate buffer saline；以下簡稱PBS）或含有蛋白質及抗生素的輸送培養液內。輸送培養液係由細胞培養液（Minimum essential medium；MEM）或PBS或tryptose-phosphate broth（TPB）或腦心浸出液（Brain- heart infusion；BHI）等為基礎液，再加0.5～1%牛血清白蛋白或明膠（Gelatin）及抗生素（具有保護病毒及抑制細菌之效果）。 ４、 輸送與保存：採集之病材應馬上以低溫冷藏方式輸送至檢測實驗室或存放於 4℃ 最多4天。需長期保存之診斷病材應存放於 -80℃，避免重覆解凍。若以乾冰保存或輸送則需將病材密封，以防二氧化碳之滲入，致pH值降低而造成病毒不活化。 (二) 病毒分離 　　分離AI病毒需用SPF或SAN的雞胚胎蛋為接種材料。 １、 病材處理： () 喉頭氣管拭子及共泄腔拭子試管以震盪器混合均勻後靜置備用。 (２) 組織病材與輸送培養液混合研磨成10%（W/V）乳劑，處理完成之病材乳劑於室溫中1～2小時內儘速接種完成，若放於 4 ℃ 僅能保存數天，否則應存放於 -80 ℃ 。 (３