时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展及在食品安全领域-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.11.4.17 时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展及在食品安全领域中的应用 随着分析方法的飞速发展，无论是食品中有毒有害物质，还是环境中痕量元素的 检测，或者生物体内功能因子的分析，都迫切需要一种灵敏度高、快速准确、性 能稳定的痕量分析方法。时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，简称为 TRFIA ）是 20 世纪 80 年代中期发展起来的一种新 的荧光标记技术。这种方法应用某些特殊的稀土金属，能够区分背景光的散射所 引起的干扰，从而大大地提高了分析的灵敏度。与传统的酶免疫法（EIA ）、发 射免疫分析法（RIA ）相比，它具有很多优点:灵敏度高达 10-19；稳定性好，克 服了酶和放射性荧光物质的不稳定性；动态范围宽；试剂货架期长；无放射性危 害等,时间分辨荧光分析目前被公认为是灵敏度最高的分析方法之一[1,2]。 一、时间分辨荧光免疫分析法的原理及优势 时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA ）是在荧光分析（FIA ）的基础上发展起来的 一种特殊的荧光分析法[3]。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物 为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代 替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测 仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，准确 地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA 所使用的荧光标记物是镧系稀土金 属[4]，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命(微秒级) ，有别于传统荧 光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光（钠秒级），正是由 于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再 测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯 合物荧光很宽的 Stokes 位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧 光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光 检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检 测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强 100 万倍，以上各种因素使 TRFIA 的检测灵敏度和准确性大大提高。 二、TRFIA 的反应模式 目前在实践中应用的主要有固相双位点夹心法和竞争法。夹心法多用于蛋白质类 大分子化合物的测定，竞争法多用于小分子半抗原的检测。反应模式流程如下： 中国试剂网 3.11.4.17 1、双抗体夹心法（检测抗原） 一抗包被、封闭→加入检测样品→加入 Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测。 2 、竞争法（检测抗体） 抗原包被、封闭→加入一抗/检测样品→加入 Eu3+标记的二抗→加入增强液→检 测。 三 、传统 TRFIA 的改进 1、酶放大的时间分辨荧光免疫分析法 Papanastsiou-Diamandi 等[5]报道这种分析技术，其原理与常规方法完全不同。本 方法以碱性磷酸酶催化底物 5- 氟水杨酸磷酸酯（FSA ），FSA 与稀土离子 Tb3+ 作用生成 FSA －Tb3 + -EDTA 三元复合物。结合后的 Tb3+在紫外光激发下可发 出很强的荧光信号。不加增强液即可在时间分辨荧光仪上测量 Tb3+ 的特征荧 光。近年，我国赵启仁等[6,7]也利用酶放大的时间分辨荧光分析法进行核酸杂交 和碱性磷酸酶的测定，灵敏度达到 10pg。 2 、链霉亲和素-生物素(SA-biotion)系统的时间分辨荧光免疫分析法 由于链霉亲和素（SA ）不带糖基、等电点低，在检测中具有比亲和素(AV)低的 背景而大大提高了检测的灵敏性。SA-biotin 系统可偶联抗原、抗体、报告酶、 寡核苷酸分子以及 PE 等荧光物质，因此，SA-biotin 被广泛用于生物反应检测系 统，用以检测抗原、抗体及核酸分子[8]。 Andreas Rossler[9]利用链霉亲和素-生 物素系统的时间分辨荧光分析法检测人体血液中玻尿酸的含量，灵敏度达到小于 0.24mg/L 也能检测出来。血液中的玻尿酸的含量可以作为许多疾病诊断的标志， 对于许多疾病的前期诊断具有很大