番石榴焦腐病菌LAMP检测方法的建立及应用-植物病理学报.PDFVIP

植物病理学报 ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(６):５７４￣５８０(２０１３) 番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立及应用 １ ２ ２ ２ ２ １ꎬ２∗ ２ 吴敏亮 ꎬ 张溢溪 ꎬ 兰成忠 ꎬ 刘裴清 ꎬ 李本金 ꎬ 陈庆河 ꎬ 翁启勇 １ ２ ( 福建农林大学植物保护学院ꎬ 福州 ３５０００２ꎻ 福建省农业科学院植物保护研究所ꎬ 福州 ３５００１３) 摘要:以钙黄绿素(ｃａｌｃｅｉｎ)为指示剂ꎬ建立了番石榴焦腐病菌(Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ)的环介导等温扩增(Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＬＡＭＰ)可视化快速检测方法ꎮ 在该方法中ꎬ以番石榴焦腐病菌特异的核糖体转录间隔区(Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒꎬＩＴＳ)序列为目的ＤＮＡ片段ꎬ设计４条引物(２条内引物、２条外引物)ꎬ优化ＬＡＭＰ反应条件和反应体系ꎬ 并进行特异性和灵敏度验证ꎮ 研究确定最佳反应温度为６４℃ꎬ反应时间１ｈꎻ特异性检测结果显示ꎬ１５株不同地理来源的 番石榴焦腐病菌和１０份番石榴焦腐病病果组织ＬＡＭＰ产物均为阳性(绿色)ꎬ而２６株其它病原菌及１０份健康番石榴果实 组织ＬＡＭＰ产物均为阴性(橘黄色)ꎻ灵敏度验证结果显示ꎬ该方法的检测灵敏度在ＤＮＡ水平上可达到１０ ｐｇꎮ 实验结果 表明ꎬ快速、准确、灵敏的ＬＡＭＰ检测方法适合基层部门及田间检测番石榴焦腐病菌使用ꎮ 关键词:番石榴ꎻ葡萄座腔菌ꎻ内转录间隔区ꎻ环介导等温扩增ꎻ钙黄绿素 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ １ ２ ２ ２ 　 ＷＵ Ｍｉｎ￣ｌｉａｎｇ ꎬＺＨＡＮＧ Ｙｉ￣ｘｉ ꎬＬＡＮ Ｃｈｅｎｇ￣ｚｈｏｎｇ ꎬＬＩＵ Ｐｅｉ￣ｑｉｎｇ ꎬＬＩ ２ １ꎬ２ ２ １ Ｂｅｎ￣ｊｉｎ ꎬＣＨＥＮ Ｑｉｎｇ￣ｈｅ ꎬＷＥＮＧＱｉ￣ｙｏｎｇ 　 ( ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉ￣ ２ ｔｙꎬＦｕｚｈｏｕ ３５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＦｕｚｈｏｕ ３５００１３ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａ ｖｉｓｕａｌ ＬＡＭＰ (Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＢｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｅｉｎ ａｓａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＩＴＳ (Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ) ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＢ. ｒｈｏｄｉｎａꎬａ ｓｅｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ＬＡＭＰｐｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ.Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ.Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ６４℃ ｆｏｒ １ｈ ｗａｓｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆＬＡＭＰ.Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ １５ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａ