第三节遗传工程.PPTVIP

第四节 遗传工程 一 遗传工程的概念 1 广义：包括基因工程，细胞工程，染色体工程，细胞器工程等。 2 狭义：基因工程：按照人们预先设计的方案，借助于实验室技术，将一种生物的基因或基因组转移到另一种生物细胞中去，并使后者定向地获得新的遗传性状，从而使生物基因组得到改造的技术。 基因工程的基本步骤（主要） （1）?? 准备材料：目的基因，载体和工具酶等。 （2）??目的基因与载体结合形成重组DNA分子。 （3）??重组DNA分子引入受体细胞，并克隆。 （4）??筛选目的基因在受体细胞能够正确表达的无性繁殖系。 二 基因工程的操作 （一）目的基因的分离 1 鸟枪法（SHOTGUN）鸟枪射击法 将含有目的基因的基因组DNA，用适当的限制性内切酶切割成片段，再与载体进行体外重组，（质粒 ，或酵母人工染色体）形成重组DNA分子，转化到大肠杆菌，形成基因文库，然后用探针钓取目的基因。 目前也有的用mRNA分离法，转座子示踪法及T-DNA插入突变法和图谱克隆法。 2 化学合成法 根据DNA碱基互补原则（根据）按照目的基因的核苷酸顺序，利用连接酶，将单核苷酸或寡核苷酸片段一个个地连接起来，配成双链。 （二）载体与工具酶 1 载体 A. 要求能独立自我复制，拷贝数较多。B.有多种限制酶的酶切位点，每种E最好只有一个切点，（酶切后）插入外源DNA后不影响其自我复制能力及选择标记基因。C.具有作为重组DNA分子的选择的遗传标记。 质粒是一种细菌染色体以外的遗传单元，如F因子，R因子，col E1因子等 噬菌体也是一种好的载体，如入噬菌体（50kb） 病毒 SV40寄生在灵长类的细胞中的一种病毒，具有自我复制及整合能力的DNA分子，一直被认为是动物基因工程的理想载体。 工具酶 限制性内切酶 根据限制性内切酶的切割特点进行分类，可分为两类 : 割部位无特异性的酶，能切断DNA分子中双链，需要ATP，Mg++，S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子。例如，EcoB和EcoK，由于切割部位不固定. 切割部位具有特异性的酶，能切断双链，能识别特定的碱基序列，切割部位具有特异性，需要Mg++作辅助因子，是遗传工程中采用最多的一种酶。EcoRI，嗜血杆菌的HindⅢ这一类切内酶多数具有粘性未端. （三）重组DNA分子的构建 若目的基因和载体基因采用同一种能产生粘性未端的切内酶切割，二者具有互补的粘性末端，采用DNA连接酶（T4DNA连接酶）连接起来。 平齐未端的连接，采用末端核苷酸转移酶，在末端添加单核苷酸，在一个DNA片段上添加多聚T，另一个片段上添加多聚A，从而使二者粘性末端互补，再通过连接E连接起来。 （四）外源DNA引入受体细胞进行克隆及筛选 DNA理化转移方法（无载体基因工程）主要方法有： A . PEG（聚乙二醇）法，使DNA沉淀，剌激细胞内摄，原生质体无损伤，通过重组整合实现转化。 B . 电融合法，电脉中使原生质膜产生瞬时孔洞，使DNA进入细胞。 C . 微注射法，在显微镜下，用玻璃毛细管直接将DNA注射到受体核内。 D. 基因枪法，是将DNA附着在钨弹或金弹粒子（1-3μm）表面，借助爆炸力或电子冲击波打入细胞。 E. 碳化硅纤维介导DNA法。 F. 花粉管通道法，指植物授粉2-24小时，外源DNA能沿尚未关闭的花粉管通道进入细胞。 载体法 重组DNA引入受体细胞，因所用载体不同而采用不同的方法。 以质粒为载体——转化，而以噬菌体为载体——转染，但二者无本质的区别，都是把外源DNA导入受体细胞。 成功的关键有三个条件 A 外源DNA必须是双链。 B 合适的受体细胞。 C 感受态的受体细胞。同时要求外源DNA要有一定的浓度。CaCl2和热击处理（42-45℃）。 重组体的选择 主要是通过选择标记基因进行筛选，如大多数载体都带有抗药性的选择重组体。而目的基因是否存在，还要通过探针进行原位分子杂交来加以选择。 （五）基因的表达 选用适宜的启动子 如植物基因工程中应用较好启动子主要有CaMV35S（花椰菜花叶病毒）玉米Adh-1，果蝇copia等。 目的基因整合位置和方向也与表达有关。 三 植物细胞工程 遗传工程的一个组成部分，它是在细胞水平上研究细胞及组织培养，细胞融合，核移植，细胞器摄取，试管受精等现代技术。 细胞分离 原生质体融合 杂种细胞的选择 诱导愈伤组织形成 植株分化 * *