生化试验基本技术.docVIP

第二章 生化实验基本技术第一节离心分离技术离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g，即重力加速度(980.cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速：离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动从而产生一个强大的辐射向外的离心力场它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度使之受到一个外向的离心力其定义为 F = mω2r 式中F为离心力的强度m为沉降颗粒的有效质量ω为离心转子转动的角速度，其单位为rad/sr为离心半径(cm)即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。 通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力“ RCF”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000×g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”(980cm/2)，此时“RCF”相对离心力可用下式计算： RCF = 1.119×105×(rpm)2 ×r ( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min ) 由上式可见只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替： rav=( r min＋rmax)/2 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值(RCFa v)，即离心管中点的离心力。为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias利用RCF的计算公式，制作了转速rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便。换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于rpm标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值，转数值处于rpm标尺左边，则应读取RCF标尺左边的数值。Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。将左侧r点与右侧n点连成一条直线，与中间RCF相交的点即为相对离心力(×g) RCF=1.118×102×r×n2二)沉降速度与沉降系数 一个颗粒要沉降，它必须置换出位于它下方等体积的溶液，这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到，否则，在离心过程中颗粒将发生向上漂浮，而不是下沉。当颗粒在运动时，不论方向如何，它都要穿过溶剂分子所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正