酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能豚鼠精子上的分布与表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（４）：８９～９３ 酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能豚鼠 精子上的分布与表达 孔丽娟　李忠浩　黄静燕　代婷婷　王根林 （南京农业大学动物科技学院　南京　２１００９５） 摘要　为研究豚鼠精子获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化的变化规律，将豚鼠精子悬浮于改良的 ＴＡＬＰ获能培养基中，在５％ ＣＯ孵箱３７℃培养，以精子与金霉素（ＣＴＣ）荧光结合类型为指标评 ２ 价精子获能状态，用免疫荧光技术和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测酪氨酸磷酸化的蛋白在精子上的分布 以及酪氨酸磷酸化水平的变化。结果显示，随着获能的进行，发生蛋白酪氨酸磷酸化的精子占总 精子的百分比增加，由未获能前的３６％增至获能７ｈ时的９２％。酪氨酸磷酸化的蛋白分布变广， 由精子头部扩增至精子头部、鞭毛主段和中段。另外，有８０，４５，４０ｋＤａ的三种蛋白发生酪氨酸磷 酸化，其中４０ｋＤａ的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势，４５ｋＤａ的蛋白酪氨酸 磷酸化自培养３ｈ后发现并呈递增趋势，而８０ｋＤａ的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养３ｈ时最 高，后呈递减趋势。 关键词　精子获能　酪氨酸磷酸化　豚鼠 中图分类号　Ｑ２５ 　　精子获能是精卵受精前，精子在雌性生殖道内经 得很大进展，但目前关于（体外）获能过程中，酪氨酸磷 过一段时间后成熟的过程，只有获能的精子才具有受 酸化蛋白在精子上的分布及酪氨酸磷酸化水平的变化 精能力。精子在获能过程中发生一系列变化，包括精 规律少有报道，而对豚鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化的研 子质膜流动性增加，胆固醇外流，离子流动，酪氨酸磷 究仍为空白。本实验研究豚鼠精子获能前后酪氨酸磷 酸化蛋白增多，精子超激活运动以及顶体反应的诱导 酸化蛋白在精子上的分布特征，为探讨豚鼠精子获能 等。其中蛋白酪氨酸磷酸化是翻译后加工修饰过 的分子机理奠定基础。 程［１］。真核细胞中，蛋白的磷酸化／去磷酸化是调节蛋 白生物活性最普遍的方式之一，通过它能调节细胞的 １　材料和方法 许多生理活动。成熟精子是高度分化的特异细胞，不 １．１　试验动物 能转录翻译合成新的蛋白质。因此，蛋白酪氨酸磷酸 　　种用公豚鼠（体重７２０～７５０ｇ），购自南京江宁区青 化对精子运动力的维持、精子获能、超激活运动以及顶 龙山动物繁殖场。 体反应等生理过程十分重要，这在小鼠、人和其他许多 １．２　试剂与仪器 物种上都有报道［２～４］。 　　金霉素（南京大治生物技术有限公司分装， ［５］ 　　自Ｌｅｙｔｏｎ等 首次用磷酸化特异性抗体证明小鼠 Ａ１９４６），荧 光 防淬 灭 剂 （ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ，Ｖｅｃｔｏｒ 精子上存在分子量为９５ｋＤａ的蛋白发生酪氨酸磷酸化 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．），抗磷酸酪氨酸单克隆抗体（Ｃｅｌｌ 以来，有关精子获能时蛋白酪氨酸磷酸化的研究已取 Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９４１１），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ标 记 的羊抗 鼠 ＩｇＧ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃４０１２１７），ＳｕｒｐｅｒＥＣＬＰｌｕｓ超敏发光液（普 收稿日期：２００６１１２０　修回日期：２００７０１２６ 利莱基因技术有限公司，＃Ｐ１０１０ａｎｄ＃Ｐ１０２０），预染 国家