临床PCR实验室基本设置要求.ppt

临床PCR原理及实验室基本设置要求 主要内容 PCR的原理及特点 PCR实验室布局设置 PCR实验室仪器设备 一、PCR原理及特点 PCR技术的原理 在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种dNTP,Taq酶,一对引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每次循环使特异区段的核酸拷贝数放大一倍,经过30次循环,最终使基因放大数百万倍 PCR原理与特点 　　　　　　　　　　　 1. PCR反应体系: DNA 聚合酶 　　　　　　　　 DNA 靶序列 　　　　　　　　 两端引物 　　　　　　　　 脱氧核苷酸dNTPs 　　　　　　　　 缓冲液 2. DNA的合成方向 5’ 3’ 3. Taq DNA聚合酶的作用 4. PCR循环： 变性 　　　　　　　 退火 　　　　　　　 延伸 Mg2+ dCTP dGTP dTTP dATP Taq DNA聚合酶 Primer 加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA变性 解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,这称DNA复性,也叫退火。 PCR 循环 第一步 － 变性 （９３～９８℃） PCR循环 PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃） PCR循环 PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃） PCR循环 第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制 PCR循环 循环次数 DNA的链数 1 　 21 2 2 　22 4 3 　 23 8 10 　 210 1024 20 　220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与DNA产量关系 PCR循环 PCR特点：高效扩增、忠实复制 灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量 PCR反应的特点 二、PCR实验室布局设置 生物安全二级实验室 目的 保护操作人员 保护环境 保护样品 临床PCR实验室工作流程 试剂储存和准备 标本制备区 扩增区 产物分析区 PCR实验室平面设计 ○在入口处设缓冲间○缓冲间比专用走廊更有意义。 有问题！ 建筑结构 阴角 均采用 圆弧线条密封 洗手池 三、实验室设施、仪器设备 临床基因扩增检验实验室应有充分合理的分区、空间、良好的照明和空调设备 实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循环仪？水浴箱和/或恒温干浴仪？ PCR实验室各区的设备配置表 分区 器材选配 PCR① 试剂区 PCR② 制备区 PCR③ 扩增区 PCR④ 分析区 PCR仪器 生物安全柜 加热模块、离心机 产物分析仪 冰箱、混匀器 √ √ √ √ 移液器 √ √ √ √ 可移动紫外车 √ √ √ √ 办公用品、耗材 √ √ √ √ √ √ √ 仪器设备及管理 加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护 生物安全柜：维护 冰箱：维护