植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定.doc

实验四 植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定 一、目的 从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。 二、原理 （一）分离提取原理 在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。 （二）测定原理 1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定 碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。此法灵敏度高，糖含量达30 (g即可测定。 2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定 氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。 3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定 考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 (g /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。 三、实验用品 （一）实验材料：植物样品。 （二）器皿： 1. 25 mL刻度试管(8 ，15 mL试管(20； 2. 10 mL离心管(2； 3. 容量瓶：50 mL(1 ，25 mL(1； 4. 移液管：5 mL(2，2 mL(4，1 mL(2，0.1 mL(2； 5. 恒温水浴锅； 6. 离心机； 7. 电子天平； 8. 分光光度计。 （三）试剂： 1. 样品分离提取 （1）80%乙醇； （2）9.2 mol/L 高氯酸，4.6 mol/L 高氯酸； （3）0.1 mol/L 氢氧化钠； 2. 可溶性糖及淀粉测定 （1）葡萄糖标准液（100 μg/mL）：0.1 g无水葡萄糖溶于蒸馏水中，定容至1000 mL； （2）硫酸-蒽酮试剂：0.2 g蒽酮，1 g硫脲（阻氧化剂），缓缓加入100 mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存； 3. 氨基酸测定 （1）60%乙醇； （2）水合茚三酮：1.2 g茚三酮，加入30 mL正丙醇，搅拌使其溶解，再加入60 mL正丁醇和120 mL乙二醇，最后加入18 mL pH 5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，贮于棕色瓶，4℃冰箱保存； （3）乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.4):乙酸钠54.4 g，加入100 mL蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半，冷却后加30 mL冰乙酸，用蒸馏水稀释至100 mL； （4）标准氨基酸（5 μg/mL）：取80℃下烘干的亮氨酸11.7 mg，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至25 mL，取5 mL，用蒸馏水稀释至50 mL； （5）0.1%抗坏血酸：50 mg抗坏血酸溶于50 mL蒸馏水中。现用现配； 4. 蛋白质含量测定 （1）牛血清蛋白标准液（1000 μg/ml）：100 mg牛血清蛋白溶于100 mg蒸馏水中，贮于4℃冰箱； （2）考马斯亮蓝G-250溶液：100 mg考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL95%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000 mL。 四、操作步骤 （一）分离提取（每次离心转速3000-3500rpm） （二） 测定 1. 可溶性糖及淀粉的测定 （1）按下表制作标准曲线 管号 试剂(mL) 1 2 3 4 5 6 7 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 葡萄糖标准液 (100 (g/mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 硫酸-蒽酮 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 加入硫酸-蒽酮试剂时，最好将各管放在冷水中，沿管壁缓缓加入，全部加完后再混匀。将以上各管在100℃水浴中加热10 min，取出后用自来水冷却，620 nm比色测定。 （2）样品测定 分别取可溶性糖提取液、淀粉提取液各1mL+1mL蒸馏水（根据含量而定），显色与标准曲线相同。 （3）计算 2. 淀粉测定 吸取上述淀粉提取液2 mL（或1 mL+1 mL水）于大试管中，用测定可溶性糖的方法测定。 3.