细胞悬浮培养中.pptVIP

5 细胞悬浮培养;;5.1悬浮培养的方法 ; 是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。; 在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。 ;一般是100～250 ml三角瓶，每瓶中装有20～75 ml培养基。; 为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释5倍）。; 滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。; 另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每2～3d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。 据报道，加入条件培养基（即在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基）可以显著缩短滞后??的长度。 ; 如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。 ;提高细胞分散程度的方法; 已知加入2, 4-D，少量水解酶（如纤维素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的物质，都能促进细胞的分散。; ; 在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团（(2-4个细胞），而不能通过大的细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。;但是必须记住，即使在分散程度最好的悬浮液中也存在着细胞团，每个细胞团由几个或几十个细胞组成，只含有游离细胞的悬浮液是没有的。这是因为植物细胞具有集聚在一起的特性，由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞，不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。;（二）连续培养（continuous culture）;加入培养基;连续培养的类型; 排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。; 注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液及其中细胞的容积相等。; 开放型培养又可分为两种主要方式： （控制生长速度的方法）;5.2 细胞悬浮培养的培养基;条件培养基的使用方法 ;培养基的振荡 ;在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以使用各种类型的设计。 ; 旋转培养器;液晶屏双层震荡培养器;磁力搅拌培养器;5.3 悬浮培养细胞的同步化;确定同步性的参数;物理方法和化学方法。 ;化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。;（一）饥饿法 在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。;（二）抑制法 使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。 ;5.4 细胞增殖的测定 ;2.细胞干重;3.细胞密实体积; 当悬浮液的黏度较高时，常出现一些细胞不沉淀的情况，此时可用水稀释至2倍。但是，用水稀释后渗透压过于下降时，会出现细胞变形，将得不到真正的PCV，所以用水稀释时尽可能最低限度进行，并且动作要迅速。;4.细胞计数; 由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而通过由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数。如果先用铬酸（5％～8％）或果胶酶(o.25%）对细胞和细胞团进行处理，使其分散，解离成单细胞，则可提高细胞计数的准确性。;Street及其同事用以计数假挪威槭细胞的方法是：把1份培养物加入到2份8％三氧化铬溶液中，在70℃下加热2 ～15 min，然后将混合物冷却，用力振荡10 min，用血球计数板进行细胞计数。;;由悬浮培养细胞再生植株的途径有两种：;另一种是先将悬浮培养细胞（团）转移到半固体或固体培养基上，使其增殖形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。; 在后一种情况下，如果悬浮培养中的细胞较大，则可将培养瓶短时间静置令细胞团自然沉降后，用吸管将细胞团转到半固体培养基上培养。 这种培养基的组成基本上与继代培养基一致，但也须视情况做些调整，特别是在激素组成方面做些调整。 ; 对于单细胞、低密度悬浮细胞、或是过于细小的细胞团，则不宜直接把