第三代测序技术及其应用-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（５）：１２５１３１ 第三代测序技术及其应用 １ ２ １ １，２ 张得芳 　马秋月 　尹佟明 　夏　涛 （１南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室　南京　２１００３７） （２南京林业大学森林资源与环境学院　南京　２１００３７） 摘要　第二代测序技术发展到一定阶段以后其缺陷逐渐显现，而第三代测序技术的出现在一定 程度上弥补了第二代测序技术在应用方面的缺点。就目前正在发展的５种第三代高通量测序技 术的原理进行了阐述，并比较了这几种测序技术的优缺点，最后对三代测序技术在基因组测序， 甲基化研究，ＲＮＡ测序以及医学方面的应用作了简单介绍。 关键词　第三代测序　单分子测序技术　ＳＭＲＴ　ｔＳＭＳ 中图分类号　Ｑ５２３＋．８ 　　随着测序技术的不断发展，第二代高通量测序技 １　测序平台介绍 术已经广泛地应用于各项研究领域中，但其不足之处 也日益凸显。例如，第二代测序读长较短，对后续的序 １．１　并行单分子合成测序技术 ［１］ 列拼接，组装以及注释等生物信息学分析带来困难 。 　　ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ是第一个设计开发单分子测序 ＴＭ ［７８］ 该技术原理是建立在 ＰＣＲ的基础上，扩增后得到的 方法（ｔＳＭＳ ）技术平台的公司 ，其基础主要来自于 ［９］ ＤＮＡ分子片段的数目和扩增前 ＤＮＡ分子片段的数目 Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ等人的研究 。主要是利用合成测序理 ［２］ ［１０］ 比例有相对偏差，而对基因表达分析有很大的影响 ， 论 （图１），测序时首先将待测序列打断成小片段并 ［３］ 尤其是对大量表达的基因影响会更大 。这些缺点在 在３′末端加上ｐｏｌｙＡ（图１ａ），并用末端转移酶阻断（图 一定程度上制约了第二代测序技术的应用和发展，因 中标注为Ｆ１），同时在玻璃芯片上随机固定多个 ｐｏｌｙＴ ［４６］ 此第三代单分子测序技术应运而生 ，因其采用单分 引物（其末端皆带有荧光标记），将小片段ＤＮＡ模板与 子读取技术，有着更快的数据读取速度；同时不需要 检测芯片上的 ｐｏｌｙＴ引物进行杂交并精确定位（图 ＰＣＲ扩增步骤，进一步降低了测序成本。 １ｂ），通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立 　　现有的第三代测序平台主要有：Ｈｅｌｉｃｏｓｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ 边合成边测序的位点（图１ｃ）；逐一加入荧光标记的单 ＴＭ 公司的ｔＳＭＳ （ｔｒｕｅｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术平 色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内 台，美 国 ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公 司 的 ＳＭＲＴ（ｓｉｎｇｌｅ 反射显微镜（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＩＲＭ） ｍｏｌｅｃｕｌｅｒｅａｌｔｉｍｅ）技术平台；美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公 进行单色成像（图１ｄ），之后切开荧光染料和抑制基 司的基于ＦＲＥＴ测序技术和美国ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ公司、英国 团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入（图１ｅ）。通 ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＮｅｃｈｎｏｌｏｇ