小鼠ccl20mrna实时荧光定量pcr检测方法的建立-江苏大学.pdfVIP

第２２卷第４期 江 苏 大 学 学 报（医学 版） Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．４ 　 ２０１２年７月 　 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ） Ｊｕｌ．２０１２ 　 　 　 　 　 　 小鼠ＣＣＬ２０ｍＲＮＡ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立 陈艳红，朱晨露，魏衍财，秦伟，田洁，袁靖， 陈娟，吴晶晶，汤新逸，许化溪，王胜军 （江苏大学检验医学研究所，江苏 镇江２１２０１３） ［摘　要］　目的：建立检测小鼠脂肪组织中趋化因子 ＣＣＬ２０（ＣＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｌｉｇａｎｄ２０）ｍＲＮＡ的实时荧光定量 ＰＣＲ （ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｑＲＴＰＣＲ）的方法。方法：分离小鼠脂肪组织细胞，经ＰＭＡ和离子霉素刺激 ４ｈ后收集细胞提取总ＲＮＡ并逆转录为ｃＤＮＡ。采用ｑＲＴＰＣＲ方法检测趋化因子ＣＣＬ２０ｍＲＮＡ的表达水平。评价该 方法的特异性，同时应用该方法检测小鼠脂肪组织中趋化因子ＣＣＬ２０ｍＲＮＡ相对表达水平。结果：建立了小鼠脂肪 组织中趋化因子ＣＣＬ２０的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，结果显示该方法的熔解曲线为单峰，同时核酸电 泳显示一条特异性条带。检测结果表明高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织中趋化因子ＣＣＬ２０的相对表达水平明显 高于正常饮食对照组（ｔ＝３．０２，Ｐ＜０．０５）。结论：建立了检测小鼠脂肪组织中趋化因子ＣＣＬ２０ｍＲＮＡ的实时荧光定 量ＰＣＲ方法，特异性好、灵敏性强，为进一步研究小鼠ＣＣＬ２０的生物学功能提供了实验基础。 ［关键词］　趋化因子ＣＣＬ２０；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ；实时荧光定量ＰＣＲ ［中图分类号］　Ｒ３９２　　［文献标志码］　Ａ　　［文章编号］　１６７１－７７８３（２０１２）０４－０２９９－０３ ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅＣＣＬ２０ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣＨＥＮＹａｎｈｏｎｇ，ＺＨＵＣｈｅｎｌｕ，ＷＥＩＹａｎｃａｉ，ＱＩＮＷｅｉ，ＴＩＡＮＪｉｅ，ＹＵＡＮＪｉｎｇ，ＣＨＥＮＪｕａｎ， ＷＵＪｉｎｇｊｉｎｇ，ＴＡＮＧＸｉｎｙｉ，ＸＵＨｕａｘｉ，ＷＡＮＧＳｈｅｎｇｊｕｎ （ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘｂａｓｅｄｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｅｍｏｋｉｎｅＣＣＬ２０ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｔｏｔａｌｃｅｌｌｓｏｆ ｍｕｒｉｎｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｕｂａｔｅｄｔｈｅｍｗｉｔｈＰＭＡａｎｄｉｏｎｏｍｙｃｉｎａｔ３７℃ｆｏｒ４ｈ， ｔｏｔａｌＲＮＡｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｅｐａｒａｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｒｅｖｅｒｓｅｌｙｉｎｔｏｃＤＮＡｓ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｏｕｓｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅＣＣＬ２０ｍＲＮＡｉｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉ ｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｍｅｌｔｉｎｇ