CRISPR-CAS 系统介导的新一代基因靶向修饰技术及其在工业.PDFVIP

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2017, 57(11): 1621-1633 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Genome Editing 基因组编辑 CRISPR-CAS 系统介导的新一代基因靶向修饰技术及其在工业 微生物中的应用 * 程妙文，罗玮 ，杜瑶 江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122 摘要：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)是一种广 泛存在于细菌和古细菌基因组中含有间隔重复序列的基因结构，可由RNA 介导为细菌提供一种特异性 免疫保护机制，抵御外来病毒、噬菌体的二次侵染。通过对 CRISPR/CAS 系统Ⅱ进行改造，该系统成 为了继锌指核酸酶(ZFNs)和 TALE 核酸酶(TALENs)以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的技 术，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。目前CRISPR/Cas 技术已经应用于微生物、哺乳动物细 胞、果蝇和水稻等多种生物体中，在基因修饰方面也取得了一定的成果。本文从CRISPR/Cas 系统的结 构、分类、基因组编辑的分子机制，以及在工业微生物中的应用和存在问题、前景等方面进行了综述。 关键词：CRISPR/Cas 系统，特异性免疫，定点修饰，基因编辑，工业微生物 随着新一代基因测序技术的出现和发展，越 在2012 年被Science 评为十大重要科学进展之一。 来越多物种的全基因组序列将会被快速解析。面 在基因组靶向修饰技术中，锌指核酸酶(Zinc-finger 对海量的基因组数据，如何高效进行基因功能的 nucleases ，ZFN) 以及类转录激活因子效应物核酸 确定和快速进化成为功能基因组学的重要研究内 酶(Transcription activator-like effector nucleases ， 容。基因定点编辑技术是研究基因功能的一种基 TALEN)技术的应用较为广泛，取得了令人瞩目的 本策略，研究人员可以直接编辑或修饰DNA 序列， 成就。然而，两者在结合结构域的改造筛选以及 迅速获得基因功能和相关信息，并使这些生物基因信 组装都存在着较高的技术难度，并且筛选的工作 息得以充分利用[1]。自1987 年Thompsson[2]构建ES 量很大，成为限制其发展的瓶颈[3] 。 细胞基因敲除小鼠模型至今经过近30 年的发展， 近年来，广泛存在于细菌和古菌等原核生物 基因组编辑技术日趋成熟从而得以广泛应用，并 中的一种获得性免疫系统 CRISPR 系统受到广泛 基金项目：国家自然科学基金 ；江苏省自然科学基金(B *通信作者。E-mail ：wluo@ 收稿日期：2017-01-24 ；修回日期：2017-05-27 ；网络出版日期：2017-06-29 1622 Miaowen Cheng et al. | Acta Microbiologica Sinica , 2017, 57(11) 关注，该系统能够特异性识别并结合噬菌体 一个典型的 CRISPR/Cas 基因座由一个编码 DNA ，通过转录产物crRNA 介导Cas 蛋白识别并 Cas 蛋白的操纵子以及一个重复- 间隔(repeat- 抵御外源性 DNA[4] 。根据这一原理构建的基因组 spacer)序列组成。如图 1 所示，CRISPR 位点为 靶向修饰技术被称为第三代基因组编辑技术，同 CRISPR 基因座(CRISPR locus) ，基因座中包含有 ZFNs 和 TALEs 技术相比，CRISPR/Cas9 系统具 重复序列(Repeats)和间隔序列(Spacers) ，CRISPR 有高效性、普适性、低成本，易操作等多种优 位点与上游的前导序列(Leader sequence ，LS) ， 点，将基因靶向