荧光定量PCR原理及实验步骤.doc

荧光定量PCR原理及实验步骤 一、实时荧光定量PCR原理常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析扩增曲线 ： 荧光阈值：Ct值：标准曲线SYBR Green工作原理： 1、SYBR Green? 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green? 只有和双链DNA结合后才发荧光 3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。 二、实验步骤 1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。 将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen的用量。 反应体系（25μL）如下： H2O 11μL SYBgreen 12.5Μl 上游引物 0.25μL 下游引物 0.25μL cDNA 1μL 可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。 4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。上机。