间接ELISA测定抗体的效价.doc

间接ELISA测定抗体的效价 【目的】 测定样品中抗体的效价（Titer） 【基本原理】 将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合（Ag-Ab），再加入酶标记的抗抗体（亦称二抗），与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 1.包被 固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体表面性质等有关。缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。 2.封闭 由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。可用含1％BSA、1％明胶3－5％脱脂奶粉封闭。酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。 3.温育 温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。且板上应加盖，避免蒸发。应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。 4.待测样品 待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 5.洗涤 洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。洗涤次数一般为3～4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。 6.显色 一些底物如TMB和OPD在暗处稳定，底物液要现用现配，酶促反应时注意避光。某些含苯环的底物有致癌作用，使用要多加小心。 最常用的是辣根过氧化物酶(HRP)，要求高纯度的HRP，其RZ(纯度值)应≥3.0，(RZ是HRP在403nm和275nm下的吸光值的比值)，此外比活力应＞250U/mg 。HRP的作用底物是H2O2，催化反应为： HRP DH2+H2O2———→D+2H2O DH2为供氢体(常用四甲基联苯胺，TMB)，H2O2为受氢体。 【试剂与器材】 1．实验材料 ⑴待测抗体溶液(免疫后的血清) ⑵阳性样品（阳性血清） ⑶阴性样品（阴性血清） 2．试剂 ⑴抗原： OVA-Ag的偶联物。 ⑵包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液CBS, pH 9.6)： Na2CO3 1.59g ＋ NaHCO3 2.93g 加水至1000ml； ⑶洗涤液(PBST)： 含0.05％ Tween-20的 10mM，pH7.4的PBS。 ⑷封闭液： 1％BSA、或1％明胶、脱脂奶3%~5%的PBS。不可加Tween等表面活性剂。 ⑸抗体、酶联抗体稀释液： 以含2-5mg/ml BSA的PBS或PBST稀释。 ⑹酶标的抗体： 酶标抗体宜加甘油保存在-20度，稀释的抗体不宜在4度保存超过1星期。新制备或保存过久的酶标记物，则需用棋盘法确定最适稀释度，并与参考酶标抗体（抗原）进行比较。 ⑺底物缓冲液(磷酸盐－柠檬酸缓冲液，pH5.0)： 甲液：0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7·H2O)，即称取柠檬酸21g，加水至1000mL 乙液：0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4·0H2O)，即称取磷酸氢二钠28.4g，加水至1000mL 取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。 ⑻TMB溶液： 10mg TMB溶于1mL DMSO(二甲基亚砜)中； 4℃避光可保存3个月以上，使用时在37-40℃下溶解。 ⑼TMB底物使用液： TMB 60ul ＋ 底物缓冲液 10ml ＋ 30%过氧化氢 10ul(临用前新鲜配制) 或TMB 60ul ＋ 底物缓冲液 10ml ＋过氧化脲 mg(临用前新鲜配制) ⑽终止液(2mol/L H2SO4)： 取蒸馏水177.8ml，加浓硫酸(体积比98％)22.2ml。 3．器材 ⑴酶标板（聚苯乙烯板） ⑵酶标仪（Bio-Rad 680） ⑶封口膜(Parafilm)、保鲜膜 ⑷水浴锅/恒温箱 ⑸微量移液器（50、200、1000、5000μl） ⑹吸水纸等 【操作步骤】 预实验