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大鼠原代肝细胞培养方法建立 　　摘要体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多，但均存在一些缺陷。对胶原酶灌流法进行改良，采用细胞密度为6×105个/mL，细胞生长状态好，既能保证细胞活率，又能满足下一步试验要求。用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注，胰酶最适浓度为0.18%，且灌流时维持最适温度37 ℃，分离得到的肝细胞存活率大于90%，且纯度很高，是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。 关键词细胞培养；原代；大鼠 中图分类号Q813.1+1文献标识码A文章编号 1007-5739（2013）12-0226-02 体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多[1-4]，常用的有直接剪切法[5]、组织块消化法[6]和两步胶原酶灌流法[7-8]等。由于肝细胞体外培养增殖能力差，原代培养的细胞存活率不高，故在一定程度上阻碍了肝细胞体外模型的广泛应用[9]。直接剪切法和组织块消化法所分离肝细胞杂质较多，细胞纯度不高，酶消化反应不易控制，且过多的结缔组织直接影响细胞的正常生长等，不利于细胞生物学和分子生物学的进一步研究。胶原酶灌流法分离的肝细胞数量多且活力好，是分离大鼠原代肝细胞的经典方法[3]，但由于操作方法较为复杂，限制了该方法的广泛应用。该试验对胶原酶灌流法进行了改良，试图建立一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1试验动物。健康雄性SD大鼠，体重180～220 g，由江苏大学实验动物中心提供。 1.1.2试剂及仪器。WilliamsMedium E（WME），胰岛素，青链霉素（Penicillin/streptomycin）：Sigma-Aldrich，USA；L-谷氨酰胺（L-glutamine），胰蛋白酶（trypsin），噻唑兰（MTT），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：Amresco，USA；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：Gibco，USA；其他相关试剂均为国产分析纯。 台式高速冷冻离心机5810R：Eppendorf，Germany；超纯水制备装置PS-9000705：Labconco，USA；电子天平BS210S：Sartorius，Germany；倒置相差显微镜AE21：Leica，Germany；pH计：Mettler Toledo，Switzerland；二氧化碳培养箱HF90：Thermo，USA；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A，电热恒温水槽DK-600型：上海精宏实验设备有限公司；漩涡振荡仪ZW-A：江苏金坛荣华仪器有限公司；超净工作台SW-CJ-1FD：苏州净化设备有限公司。 1.2试验方法 1.2.1大鼠肝细胞的分离。该试验对Seglen[10]两步胶原酶灌注法进行方法改良，取禁食24 h的SD大鼠，用2％戊巴比妥钠（40mg/kg.b.w）腹腔注射麻醉，并注射肝素钠抗凝；将大鼠固定，腹部皮肤消毒，沿腹中线打开腹腔，将肠拨到左侧，暴露肝门静脉和下腔静脉，在肝脏表面铺一块用37 ℃PBS浸润的纱布，并在灌流过程中用37 ℃的PBS不断浸润，保持肝脏温度利于胰酶的消化；在肝门静脉的近心端和远心端分别结扎缝合线，留置针插入门静脉，缓慢抽出针芯，若回血，说明插入正确，将缝合线扎紧，将输液器连接留置针，剪开下腔静脉近心端，用37 ℃预热D-Hanks液以流速为25 mL/min开放灌流约12 min，冲掉肝脏内的血细胞，待肝脏变为土黄色后，改用37 ℃、含0.18％胰酶的D-Hanks液以流速为25 mL/min继续灌流7 min，肝脏由土黄色变为白色；取下完整的肝脏，用含双抗（100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素）的PBS清洗3次，放入含双抗和1％ BSA-Hanks液中终止胰酶消化，并用眼科镊分离肝组织，去除肝包膜及血管等结缔组织，收集肝细胞悬液，分别用100、200目的筛网过滤肝细胞悬液，离心600 r/min，5 min，去除上清液，用1％ BSA-Hanks液重悬沉淀，500 r/min离心5 min，去上清，沉淀中加入含100 mL/L胎牛血清、100 kIU/L青霉素和100 mg/L链霉素的WME完全培养基重悬，500 r/min离心5 min，用WME完全培养基重悬沉淀得到肝细胞悬液。 1.2.2肝细胞的产量及活率的测定。在显微镜下使用血细胞计数板，通过细胞计数的方法得出细胞产量；台盼蓝排斥法检测细胞活力并计数，使用0.4％台盼蓝与肝细胞悬液以1∶9的比例混合，在显微镜下统计未染色细胞占细胞总数的百分比，计算细胞活率。 1.2.3肝细胞体外培养。试验前先用鼠尾胶原包被培养板备