实验五重组DNA技术.pptVIP

在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DNA的活细胞,加以纯化、扩增，成为克隆。 质粒DNA的提取和鉴定 碱裂解法抽提质粒DNA: 利用基因组DNA和质粒DNA变性和复性的差异来分离提取质粒。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型。而染色体DNA不易复性而形成缠连的网状结构。 进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DNA。 Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。 Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性。 加入solution II后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。 质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤。 为