环孢素A血药浓度HPLC测定方法.doc

环孢素A血药浓度HPLC测定方法 　　【摘要】 目的：建立环孢素A血药浓度的HPLC测定方法。方法：采用反相HPLC的方法，血样经乙醚萃取，正己烷洗脱等处理后测定。采用DiamonsilTM C18色谱柱，流动相为乙腈-水（74：26，V/V），流速为1 ml/min，柱温为70 ℃，检测波长为210 nm。结果：环孢素A血药浓度在50～1000 ng/ml范围内线性关系良好，R2=0.9997，低中高三种浓度的提取回收率为70.01%～75.00%，方法回收率为98.93%～103.08%，日内精密度RSD为0.84%～4.76%，日间精密度RSD为5.38%～9.87%。结论：该方法快速灵敏准确，可用于环孢素A血药浓度的监测。 【关键词】 环孢素A； 高效液相色谱； 血药浓度监测 环孢素A（Cyclosporine A，CsA）是一种强效免疫抑制剂，目前广泛用于器官和组织移植术后的预防和治疗[1]。然而CsA治疗的有效血药浓度范围为100～450 μg/L，600 μg/L以上即有中毒危险[2]，特别是肝肾毒性明显[3]。CsA治疗窗窄，个体差异大，因此，临床应用必须监测其血药浓度。本实验建立了一种简单准确的HPLC测定CsA血药浓度的方法，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 CsA 标准品，乙醚，正己烷，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），Agilent 1200型高效液相色谱仪，DiamonsilTM C18色谱柱，GENIUS 6K-D离心机，XW-80A漩涡混合仪。 1.2 标准溶液的配制 精密称取CsA标准品10.006 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作为CsA标准品储备（100 μg/mL）。用甲醇稀释，分别配成2.5、5、10、25、50 μg/ml的CsA标准品溶液。 1.3 样品的处理 1.3.1 空白血样 取人全血1～10 ml均塞离心管中，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，涡旋2 min，加入5 ml乙醚，涡旋5 min，3500 r/min离心10 min，取上清液4.5 ml，40 ℃水浴吹干，加入100 μl甲醇-0.05 mol/ml盐酸（1：1，V：V）的混合液[4]，涡旋30 s，加入250 μl正己烷，涡旋2 min，3500 r/min离心5 min，弃去正己烷，取下层溶液进样。 1.3.2 加药血样 取浓度为2.5、5、10、25、50 μg/mL的CsA标准溶液各20 μl置10 ml均塞离心管中，分别加入人全血1 ml，配置成含CsA 50、100、200、500、1000 ng/ml血液样品，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，后处理方法同“1.3.1”项下空白血样。 1.4 色谱条件的选择 色谱柱：DiamonsilTM C18（4.6×200 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（74：26）；流速：1 ml/min；柱温：70 ℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。 1.5 方法专属性 在上述色谱条件下，分别取CsA标准液，空白血样，加药血样进行HPLC测定，考察其色谱图。 1.6 标准曲线的制备 取血药浓度为50、100、200、500、1000 ng/ml加药样品进行HPLC测定，以药物浓度C与样品峰（A）做线性回归，制备标准曲线。 1.7 回收率 配制浓度分别为50、200、1000 ng/ml的加药血样，按照“1.3.1”项下的处理方法处理、测定，分别与同浓度的CsA标准溶液直接进样的峰面积做比较，计算提取回收率即绝对回收率。配制浓度分别为50、200、1000 ng/ml的加药血样，按照“1.3.1”项下的处理方法处理、测定，按：“方法回收率=测得量/理论值×100%”计算方法回收率即相对回收率。 1.8 精密度 浓度分别为50、200和1000 ng/ml的加药血样按照“1.3.1”项下的处理方法处理，测定，一日内重复操作5次，考察其日内精密度。在随后的5 d内，重复操作5次，考察其日间精密度。 2 结果 2.1 方法专属性 CsA色谱图考察结果如图1所示，可见CsA的保留时间为7.6 min左右，空白血样在此时间点无干扰，CsA与血液中的内源性物质分离良好。 2.2 标准曲线及线性范围 结果如图2所示，所得标准曲线为：A=0.0983C-1.629，R2=0.9997。 2.3 回收率 低、中、高浓度的加药血样的提取与方法回收率见表1。低、中、高浓度的加药血样的日内与日间精密度见表2。 3 讨论 个体化给药是临床用药的发展趋势，血药浓度监测是临床药学的重要任务，因此，建立高效准确，