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安徽乌菜SRAP技术体系优化 　　摘 要： 以合肥黄心乌为试材，利用正交试验设计，对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+ 浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度和模板DNA浓度进行5因素4水平的筛选分析，用me3-em3引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系。结果表明，安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为：10×PCR buffer 1 μL，Mg2+ 3.0 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，引物 各 0.5 mol·L-1，模板DNA 4.0 ng·μL-1，Taq聚合酶0.05 U·μL-1，总体积为10 μL。利用此反应体系对安徽乌菜进行PCR扩增并电泳检测，其结果清晰、稳定、可靠，可用于安徽乌菜的遗传分析。 关键词： 安徽乌菜； SRAP； 正交； 体系优化 安徽乌菜是安徽省的著名特产蔬菜之一，起源于南北气候区之间，对研究白菜类的进化与分化可提供有价值的线索[1]。同时，安徽乌菜具有很多优良性状和独特的商品性，如抗寒性、抗病性、耐抽薹、叶面泡皱、口感与风味等，对作物遗传改良具有重要的利用价值。加快安徽乌菜的分子生物学研究是今后进行乌菜种质资源深度开发和利用以及遗传改良的重要保障。 SRAP（sequence-related amplified polymorphism）标记是2001年由美国Li和Quiros[2]发展的一种基于PCR反应的分子标记技术，其多态性丰富、重复性好、操作简便快速、高共显性、在基因组中分布均匀、易测序以及不需预知物种序列信息的优点，使其使用成本相对较低。目前，在多种园艺作物上都建立了SRAP技术体系[3-13]。本研究利用正交试验设计对安徽乌菜SRAP反应体系进行优化，以期得到安徽乌菜的SRAP最佳反应体系，从而为今后的安徽乌菜分子生物学研究提供技术支持。 1 材料和方法 1.1 试验材料 供试材料由安徽省农业科学院园艺研究所收集提供（表1），其中合肥黄心乌用作体系优化，其他均用作体系验证。2011年8月在安徽省农业科学院园艺研究所试验地播种。试验使用PCR扩增仪为英国 Techne公司TC-512型。PCR反应的Mg2+、dNTPs、PCR-buffer、Taq聚合酶均购自上海生工生物工程技术有限公司。引物设计参照Li和Quiros发表的引物序列[2]，由上海英俊生物工程技术有限公司合成。 1.2 试验方法 1.2.1 DNA的提取 取安徽乌菜的幼嫩叶片，采用Liu等[14]改良CTAB法提取基因组DNA。1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定DNA浓度，用1×TE缓冲液稀释至20 ng·μL-1用于扩增分析。 1.2.2 SRAP-PCR反应体系优化 采用L16（45）正交试验设计，从影响PCR反应较大的Mg2+浓度（分别为2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1）、dNTPs浓度（分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mmol·L-1）、引物浓度（分别为0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）、Taq聚合酶浓度（分别为0.05、0.07、0.09、0.11 U·μL-1）和模板DNA浓度（分别为2.0、3.0、4.0、5.0 ng·μL-1）5个因素4个水平对乌菜SRAP反应体系进行优化，用me3（5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’）-em3（5’GACTGCGTACGAATTGAC-3’）引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系每处理2次重复。体系的各因素浓度水平和正交设计见表2。 1.2.3 SRAP-PCR反应程序 PCR反应在TC-512 PCR扩增仪上进行：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共5个循环；94 ℃ 变性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃ 保存。 1.2.4 PCR扩增产物的电泳与检测 扩增产物在6% 聚丙烯酰胺凝胶上电泳：60 V功率预电泳30 min，扩增产物加3 μL体积的溴酚蓝上样缓冲液后点样，于120 V恒压电泳90 min左右，待溴酚蓝电泳至胶板2/3处停止电泳。银染检测：10% 的乙醇溶液、0.5% 乙酸溶液固定15 min，0.2% AgNO3溶液染色15～20 min，蒸馏水快速漂洗2次；1.5% NaOH溶液、0.4% 甲醛溶液、1% Na2S2O3 0.33 mL·L-1显色至谱带清晰时停止，蒸馏水漂洗凝胶2～3 min，进行拍照、分析。 1.2.5 SRAP-PCR优化体系的验证 采用SRAP-PCR已优化的反应体系，对37份安徽乌菜材料