McAb的制备流程.PPTVIP

第一章 免疫组化与杂交组化的理论基础 Theory Basis of the Immunohistochemistry and Hybridohistochemistry 学习本门课程的总体要求 *1. 熟悉免疫组织化学和原位PCR的技术特点及其原理 *2.掌握免疫组织化学染色的操作流 程 *3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制 4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.了解单克隆抗体制备原理和步骤 概 论 一、什么是免疫组织化学与杂交组织化学 免疫组织化学与杂交组织化学是一门研究利用核素和非核素标记物作为显示剂，通过交联物连接的抗原抗体或核苷酸碱基配对特异的反应特性， 原位显示生物体细胞或组织中各种高分子物质（蛋白质或核苷酸）等，并可在光镜或电镜上观察的示踪科学。它是多学科的交叉产物，实用性很强。学习的目的是为了使参与选修的研究生熟悉与成功应用这项研究方法，为日后学位课题研究提供基础。 二、发展历史 这项技术本质上是一种染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来的，始于20世纪中期。 免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。 三、技术特点（优点） 1．特异性强 专一 2．敏感性高 检测阈值达ng或pg水平 3．定位准确 即可定性、定位， 又可定量 4．三位一体 形态、功能和代谢三结合 缺点：干扰多，易出现假阳性 ? 四、免疫组织化学染色操作步骤 （一）?组织处理与切片选择（第三章） （二）免疫染色的前处理（第一、二、九章等） 试剂准备（示踪，放大，标记）；消化；阻断；*（三）免疫组化染色（第四、五、六、七、八 章等） 原理、优缺点、流程 （四）免疫染色的后处理（第八、九、三 章等） 增强、衬染、封固 *（五）结果判断与对照设置（第九、十章） 方法众多，敏感不同，程序雷同， 按需选用 关键步骤：特异抗体-----桥联抗体----标记抗体 （第一抗体）（第二抗体）（第三抗体） 种系必需匹配 多克隆抗体的制备 一、相关术语的概念 1．抗原：凡具有能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物----抗体或致敏淋巴细胞在体内、外发生特异性结合（反应原性）的物质。 既具免疫原性又具反应原性的物质，称为“ 完全抗原”；只具反应原性而不具免疫原性的物质称为“ 半抗原”（hepten） 颗粒性抗原与可溶性抗原 特异性抗原与共同（或交叉）抗原 组织抗原（结构、分泌）与胚胎抗原 2.抗原决定簇：抗原分子表面的一些特殊的化学基团，其性质、数量、空间构型与抗原的特异免疫反应有关。 3．抗原的免疫原性取决于抗原的①异物性；②大分子；③表面积；④专一决定簇等。 亲合层析……免疫纯 亲合层析柱的制备： 载体（sepharose）＋亲合物（免疫吸附剂） （共价交联） 抗体----抗原；凝集素----糖基（ConA） SPA-----IgG等 4．半抗原＋载体蛋白→全抗原 交联剂：戍二醛，碳二亚胺、重氮化、琥 珀酸酐、O-羧甲基羟胺→共价结合； 载体蛋白：HAS、 BSA 、 多聚赖氨酸 、 牛甲状腺球蛋白等； （免疫原性强，易获得，交叉反应易去除） 交联要求：不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目至少20个以上） 5．特异性抗体---指由抗原激发生物机体免疫细胞产生的抗体，也可称“ 免疫抗体”。依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类，即多克隆抗体（PcAb）、单克隆抗体（McAb）和基因工程抗体。 ?二、多克隆抗体（抗血清）PcAb的 制备程序 多克隆抗体---指由不同克隆B细胞产生的抗体混合物。血清中的抗体皆是多克隆的。 1．? 抗原纯化………免疫原 2．? 免疫动物………免