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低温疗法脱除植物病毒探究进展 　　摘 要：低温疗法是近几年刚刚兴起的一种新的脱除植物病毒的方法。本文从低温疗法脱除植物病毒的原理、方法、步骤及应用情况等方面进行了综述，旨在为该方法的推广应用提供参考。 关键词：低温疗法；超低温保存；植物病毒；脱毒 中图分类号：S474+.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0106-06 Research Progress of Cryotherapy on Plant Virus Eradication Fan JianZhi， Jing ShuiHua， Yang ShuJuan， Duan ChengDing， Huang ChengXing* （Jining Academy of Agricultural Sciences， Jining 272131， China） Abstract Cryotherapy is a new plant virus eradication method developed in recent years. In this paper， the cryotherapy principle， methods， procedures and application status were summarized in order to provide reference for further application. Key words Cryotherapy； Cryopreservation； Plant virus； Virus eradication； 植物病毒是危害农业生产最大的病害之一，有“植物癌症”之称，到目前为止尚未有很有效的防治方法[1]，其中生产和保持无病毒植株材料至关重要[2～4]。传统的植物脱毒方法主要有茎尖培养脱毒法、热处理脱毒法和热处理结合茎尖培养脱毒法等。热处理脱毒法操作容易，但费时，脱毒不完全，植株存活率低；茎尖培养脱毒法脱毒率较高，但需在解剖镜下切取01～05 mm茎尖，操作和培养困难；热处理与茎尖培养相结合的脱毒法比单纯的热处理和茎尖培养的脱毒率和植株成活率高，是目前去除植物病毒较有效的方法[5， 6]。 低温疗法（Cryotheraphy）是近年兴起的一种基于超低温保存（Cryopreservation）新的种苗脱毒方法，可同步实现优良种质资源离体快繁、脱毒和中长期保存目标。其原理是：含有病毒的顶端细胞液泡较大，胞液中含有较多的水分，在超低温（-80℃以下）保存过程中易形成冰晶致死；而增殖速度较快的分生组织胞质浓，含水量少，抗冻性强，液氮保存后可获得无病毒再生植株[7]。目前该项技术已成功用于果树苹果（Malus domestica）潜隐性病毒、李属（Prunus）李痘病毒、香蕉（Musa paradisiaca var sapientum）条斑病毒（BSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）、葡萄（Vitis vinifera）病毒GVA、马铃薯（Solanum tuberosum）PSTVd和PVX病毒、草莓（Fragaria ananassa）轻型黄边病毒（SMYEV）等。 低温疗法优点：易于操作，存活率、再生率和脱毒率高，短时间内就可以生产出无病毒植株。低温疗法主要步骤： 准备带病毒植物材料—→剥离茎尖—→茎尖预处理—→组织细胞脱水处理 —→液氮处理—→茎尖再培养及植株再生—→再生植株病毒检测 1 常见的低温疗法研究现状 目前常用于低温疗法的超低温保存方法主要有玻璃化法（Vitrification）、包埋玻璃化法（Encapsulation-vitrification）和微滴玻璃化法（Droplet-vitrification），其中应用最多的是玻璃化法。 11 玻璃化法超低温保存 玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液（Plant Vitrification Solutions，PVS）中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷至玻璃化转变温度（Glassy transition temperature，Tg），从而被固化成玻璃化态（非晶态），并以这种玻璃化态在低温下保存[8]。玻璃化法超低温保存包括以下8个步骤：（1）保存材料适宜类型和状态的筛选；（2）预培养（Preculture）；（3）装载（Loading）；（4）玻璃化溶液脱水（Dehydration with PVS）；（5）投入液氮保存；（6）保存后快速化冻（Rapid warming）；（7）去除玻璃化液（De-vitrification）；（8）保存材料的活性检测和恢复培养（