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Chap6 微生物检测新技术 微生物检测：对送检样品中是否存在某种或多种特定的微生物种或类群，应用各种方法进行鉴定和分型，也包括种之间的鉴别。 检测的微生物：病毒、细菌、真菌和原生动物。 检测方法：微生物形态、生长特性、代谢类型、特异性酶反应、分子生物学技术。 过程：选择性培养基分离纯菌落，进行多项生化试验：糖类发酵、氨基酸代谢、碳氮源利用和酶类、抑菌试验。 时间：至少1d，有些长达7-10天。 微生物检测新技术包括： 基于微生物酶反应的特异性酶反应检测技术，包括显色反应和荧光反应检测技术； 基于核酸反应的杂交技术、PCR技术和基因芯片技术； 基于抗原抗体相互作用的免疫检测反应如免疫传感器技术。 第一节 特异性酶反应技术原理及其应用 1.微生物特异性酶反应检测技术原理 利用微生物具有种属特异性酶的特点，在培养基质中加入相应的显色酶底物，经微生物生长代谢产生酶水解底物释放色原物质，使培养物着色从而进行目标微生物筛选鉴别。 显色培养基所采用的显色酶底物主要包括两大类别： 1）含有荧光的显色底物：酶水解相应荧光底物后释放的荧光色原在一定波长的紫外光照射下使目标微生物的培养物呈现荧光。 2）可见光显色底物：酶水解相应的可见光显色底物后释放的色原在可见光下可使目标微生物的培养物显现特有的颜色。 色原-底物 底物+颜色 荧光化合物-底物 底物+荧光 优点： 分离与鉴定合二为一，省时、操作简便、敏感性和特异性较高。 2.微生物特异性酶的类型及其底物种类 检测的酶主要有：糖苷酶、酯酶、脂酶、DNA酶、蛋白酶和磷酸酶。 2.1辛酸酯酶法快速检出沙门菌 沙门菌中存在辛酸酯酶,它可用荧光底物4 - 甲基伞形酮辛酸酯( 4 - MU - caprylate)和显色底物SLPA - octanate等快速检测。 如MUCAP试剂含有4 - 甲基伞形酮辛酸酯,在C8酯酶作用下,底物游离出4 - 甲基伞形酮(4 - MU) ,在Columbia琼脂上的菌落添加一滴MUCAP,在UV下(366 nm)观察1～5 min,强烈蓝色荧光指示存在沙门菌。 SLPA - octanate是从C8脂肪酸和含酚生色团合成的一种酯。这种酯被沙门菌水解产生一种显色酚并紧附在菌落上,典型的沙门菌株显示红色菌落,而非沙门菌呈现白色、乳白色、黄色或者透明的菌落。 沙门氏菌显色培养基 2.2丁酸酯酶法检测卡他性布兰汉球菌 卡他性布兰汉球菌中存在丁酸酯酶。这种特性在奈瑟球菌科中大多数成员都没有。 丁酸酯酶可用荧光底物4 - MU- 丁酸酯来检测。所有布兰汉球菌菌株试验呈现阳性的荧光反应。而奈瑟球菌属呈阴性。 2.3α - 半乳糖苷酶(α - D - galactosides,α - D - GAL) 　 α- D - GAL可用来鉴别链球菌和肠球菌。 牛链球菌和粪链球菌以及它们的血清型可水解4 - MU - α - D - 半乳糖苷;包含α - D - GAL底物和比色的淀粉试验的选择性培养基可确认3种表现型微生物。 ( i)牛链球菌可进行α - D - GAL反应和淀粉比色反应; ( ii)粪链球菌只进行α - D - GAL反应; ( iii)粪肠球菌、鸟肠球菌、马肠球菌等2种反应均不进行。 2.4大肠杆菌与大肠菌群显色培养基 大肠杆菌与大肠菌群计数的显色培养基有荧光显色培养基与可见光显色培养基两种荧光显色培养基，一般采用M U G 4 -methylumbelliferyl- -D-glucuronide 检测大肠杆菌 LECC 液体培养基采用荧光显色原理和MPN 计数方法，36 ±1 ℃培养18 -24h 可以同时检测大肠杆菌与大肠菌群大肠肝菌在紫外光下观察波长=365nm 呈现荧光，大肠菌群在可见光下观察呈现蓝绿色，应用显色培养基检测大肠杆菌与大肠菌群，与传统培养方法比较而言只需培养24h 便可同时检测大肠杆菌与大肠菌群，可大大缩短检测时间提高检测效率。 2.5大肠杆菌O157:H7 (E.coliO157:H7) 检测大肠杆菌O157:H7 商业显色培养基有两类。一类即荧光显色培养基如德国Merck 公司开发的Fluorocult E. coli O157:H7 ，E.coli O157:H7 生长菌落呈绿色，在紫外灯下观察没有荧光；另外一类是可见光显色培养基，如CHROMagar 。 陆桥公司开发的E.coli O157 显色培养基，E.coli O157:H7 生长菌落呈紫红色，该培养基还可以检测产志贺样毒素(Stx) 的大肠杆菌。 李斯特菌显色培养基 第二节 基于核酸的微生物检测新技术 1.菌种鉴定（16S-rDNA) 16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相