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基因克隆模块 现代分子生物学大实验 实验一 聚合酶链式反应技术（PCR）及琼脂糖凝胶检测DNA片段 PCR扩增 PCR技术特点和应用： PCR技术具有快速、简便、灵敏等特点，已被广泛地应用于分子生物学等各个领域。 以插入到质粒载体中的特异片段为目的片段，通过载体的序列设计引物，PCR反应后可以通过电泳检测特异片段的扩增结果。 PCR技术的原理与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热会变性成两条单链的DNA分子，将对应于欲扩增区域的引物与DNA单链相辅结合的退火步骤引导新链的合成，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的dNTPs合成新生的DNA互补链的延伸步骤。各个步骤间的转换需要通过热循环的方式来完成，通过反复热循环，实现DNA序列的扩增。 PCR反应的最后结果是使特定的DNA区段得到了迅速大量的扩增。 PCR反应涉及多次重复进行的温度循环周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及中温延伸三个步骤组成。 PCR过程中靶序列的累积与循环数的函数关系 实验步骤 1） 在0.25ml的eppendorf 管中加入如下成分进行PCR反应（所有的试剂和小管都应该放于冰上） ddH2O 37.5 ul； 10×PCR Buffer 5 ul； dNTPs (Taq酶) (5ul+0.5ul) 5.5 ul ； 上游primer +下游primer (0.5 ul+0.5 ul) 1 ul； 质粒DNA 模板 1 ul； 总体积50 ul 2）加入所有成分之后，混匀，用离心机将混合液滴甩到管底。 3）在PCR仪中按下述程序进行扩增： ①94℃ 2min ②94℃ 30s； ③40-60℃（由上下游引物的Tm值决定）30s； ④72℃ X sec (一般1Kb/min，由目和片段长度决定)； ⑤重复②-④ 29次； ⑥72℃ 5min。 ⑦4℃ 4）利用DNA的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正常情况下PCR产物为一条单一清晰的条带 。 一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。 三、实验设备 移液器，tip头， tip头盒、水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶 四、实验试剂 琼脂糖，1×TAE（Tris-乙酸 0.04M，EDTA 0.001M， pH值为8.2），1mg/ml溴乙锭，载样缓冲液. 溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。 当染料分子插于后，其平面基团（菲啶环）与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这个基团 固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光。 DNA吸收254nm处的紫外线并传递给染料，而被结合的EB本身吸收302nm和366nm的光辐射，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新被激发发出荧光， EB一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为0.5μg/ml，EB见光易分解，故应在棕色试剂瓶中于4℃条件下保存。 电泳缓冲液 增加样品的密度保证样品沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于简化上样过程； 能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。 五、实验步骤 1. 用透明胶带将胶板的两端封好。 2. 称取0.16