第十五章 基因工程与现代发酵工业.ppt

1 施加选择压力 利用某些生长条件（如添加抗生素、营养缺陷型等），只让那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长，来消除重组质粒的不稳定性，以提高菌体纯度和发酵生产率。 2 控制基因过量表达 外源基因表达水平越高，重组菌往往越不稳定。 可采用两阶段培养法:发酵前期用可诱导启动子或温度敏感型质粒控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传，到后期，通过提高质粒的拷贝数或转录翻译效率，使外源基因高效表达。 外援基因诱导表达情况 图为：M、诱导1h、诱导2h、诱导3h、诱导4h、诱前 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 ⒊ 温度的影响 温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。 适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 ⒋ 溶解氧的影响 对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提 高活菌产量。 ⒌ 诱导时机的影响 对于λPL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在28～30 0C下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录； 当温度升高42 0C时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。 ⒍ pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.0～6.5。 总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 (三)基因工程菌的培养设备 应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。 发酵罐的组成有： 发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。 对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染，保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物，不能 干扰细菌代谢活动等。 五 基因工程菌培养和发酵的主要障碍及其控制 营养源成分及浓度对菌体生长的抑制及其控制 菌体代谢产物－乙酸对工程菌的生长的抑制及其控制 溶解氧的限制及其解决方法 质粒稳定性及其控制 其它因素（泡沫、CO2等） 1 营养源成分及浓度对菌体生长的抑制及其控制 问题：许多营养成分（包括碳源和氮源），如果在培养基中的浓度超过某个特定值时由于渗透压等原因，会抑制菌体的生长。如以下物质浓度高于其相应值时抑制生长：葡萄糖（50gL-1）、氨（3gL-1）、铁（1.15gL-1）、镁（8.7gL-1）、磷（10gL-1）、锌（0.038gL-1）。 解决方法：高密度培养应从低于临界抑制浓度开始，并在必要时补加营养物质以维持生长。 2 菌体代谢产物－乙酸对工程菌的生长的抑制及其控制 问题：乙酸是大肠杆菌代谢产物，其积累抑制大肠杆菌的生长。大肠杆菌在以下三种情况下生长容易产生乙