pri-mir-302／367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定.pdfVIP

重庆医科大学学报2013年第38卷第 12期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2013．Vo1．38No．12) 一 1409一 DOI：10．11699／cyx pri-mir-302／367重组慢病毒载体的构建 及其下游调节基因的鉴定 张耀林 ，马海滨z，陈冬梅 ，范 恒 ，李玉奎 (1．宁夏医科大学检验学院，银川 750004；2．宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所 ，银川 750004) 摘【 要】目的：构建可诱导表达pri—mir一302／367的慢病毒载体，并研究miR一302／367家族基因miR一302a／b／c／d和miR一367及 其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在 HeLa细胞中的诱导性表达。方法：以正常人基因组DNA为模板，PCR扩增pri—mir_ 3023／67基因。经双酶切后连接入pLV—TRE质粒 ，构建pLV—TRE一302慢病毒重组体，酶切及测序予以鉴定。将重组质粒和辅助 质粒共同转染293FT细胞 ，并测定病毒滴度。用病毒转染HeLa细胞，强力霉素(doxycline，DOX)诱导后，通过real—timePCR测 定miR一302／367家族基因及其下游调节基因的表达。实验分为诱导组(DOX+)、非诱导组(DOX一)和空白组(blank)。结果：酶切 及测序证实重组慢病毒载体pri—mir一302／367构建成功，病毒滴度为5x10TU／ml；DOX诱导72h后 ，real—timePCR结果显示 诱导组高于非诱导组和空白组(PO．05，其中miR一302a：‰ +町x=O．032，尸 +b~k=0．048；miR一302b：P肿)+ 叩x=0．001，尸m】 = 0．001；miR一302e：‰ … D0x__0．000，尸加lx+ baIrIk=O．000；miR-302d：Pmlx… D0X一=0．002，Pmx～ =0．407；miR-367：，mx… 一=0．001， 尸 … U~k=0．001；OCT4：Pmx… 一=O．000，Pl叩x… bk~k=0．001；SOX2：尸 … D0x__0．000，PDox+恨 =0．000；NANOG：尸 +佩 一=O．000， 尸mlx+ ：0．000)，而非诱导组与空 白组相比差异无统计学意义(P0．05，其中miR一302a： D0x--0．057；miR一302b：Phl础 D0x_- 0．832；miR-302c：尸 nk佩mx_=0．445；miR-302d：尸 rd傩【mx_=0．979；miR-367： D0j0．161；OCT4： nk佩吣x__O．051；SOX2： D0)(= 0．060；NANOG： 。0x．=0．078)。结论：成功构建了携带人miR一302／367可控性慢病毒载体 ，为后续的重编程研究奠定了实验 基础。 【关键词】pri—mir一3023／67；Tet—on系统；可诱导性慢病毒载体；HeLa细胞 【中国图书分类法分类号lR34 文【献标志码】A 收【稿 日期】2013—01—14 作者介绍：张耀林，Email：yaolinzhang@163．corn， 研究方向：干细胞生物学。 通信作者：李玉奎，Email：yukuili@hotmail．tom。 基金项 目：国家自然科学基金资助项 目(编号。 expressiondynamics[J]．ImmunolRev，2012，247(1)：120—132． 叨．Nature，1993，361(6412)：539—541． 6【】 MoritaR，SchmittN，BentebibelSE，eta1．HumanbloodCXCR5+ [12】MaCS，HraeNJ，NicholsKE，eta1．Impairedhumoralimmunity CD4+TcellsarecounterpartsofTfollicularcellsandcontainsp