HPV基因分型测定标准操作规程.doc

HPV基因分型测定标准操作规程 操作规程文件号：免疫- 第4版 共6页 规程编写者：叶瑾 生效日期：2008年08月11日起 批准日期：2008年08月06日 文件正本保存于：主任办公室 保管人：奚经巧 文件副本保存于：免疫室 保管人：叶瑾 检验科主任： (签名) 项目主管： (签名) 文件执行者签名： 1 检验申请 1.1具有资格的临床医生根据需要在His医生工作站提交电子检验申请单 1.2组合项目申请：HPV基因分型检测。 1.3项目所在菜单：His医生工作站上的“妇科检验”。 2 标本采集和处理 2.1 病人的准备 2.1.1 月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间； 2.1.2 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物； 2.1.3 检查前48小时最好不要行性生活； 2.1.4 检查前不进行醋酸或碘液涂抹； 2.2 标本采集 2.2.1 按医生指示，仰卧于检查床上； 2.2.2由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。 然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集标本；（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物） 2.2.3将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈； 2.2.4慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。 2.2.5 标本采集后，在电脑终端检验标本采集确认，电脑自动产生标本采集时间。 2.2.6 标本采集及确认后，临床标本要及时运送至检验科。 检验科接收人员Lis接收电脑终端刷取标本条形码接收标本，并记录状态。对不合格标本应予拒收。 2.2.7 下列标本为不合格标本： 标本无标识（条形码）； 无法辨认条形码号； 标识涂改； 未采用装有细胞保存液专用管的； 采样后未及时送检并且未能置4℃冰箱保存的； 标本采集过程中混入红细胞或分泌物过多的标本； 标本试管破裂等； 2.3 标本采集的注意事项 2.3.1 避免采集分泌物过多的标本，最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物； 2.3.2 尽量避免血性样本，若患者宫颈口充血出血，应建议改日采样。 2.4 标本保存 2.4.1 接收标本后，若不能马上检测，于4℃保存。 2.4.2 标本有效保存条件及时间：普通冰箱中(2-8℃)稳定2周。标本均密封保存。 2.4.3标本留存时间：已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内留存7天，已分离抽提的DNA样本可于-20℃保存30天。 3 方法原理 分离提取宫颈细胞内的HPV-DNA，首先进行PCR扩增，然后以凯普医用核酸分子快速杂交仪为平台在已固定好核酸探针的低密度基因芯片膜上进行导流杂交，可一次性检测21种HPV亚型。 4试剂组成：由凯普生物化学科技公司提供 4.1 DNA提取试剂：包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，试剂盒在2-8℃保存。 溶液Ⅰ临用前在45℃水浴中预热，溶液Ⅱ、溶液Ⅲ即开即用。 4.2 PCR试剂：包括PCR Mix、DNA Taq酶 , 试剂盒在-20℃保存。试剂在临用前根据比例配制。（已配制的PCR试剂不能-20℃保存，可于2-8℃保存数周） 4.3 杂交试剂：包括杂交液、封阻液、酶标液、溶液A、溶液B、杂交膜、 NBT/BCIP，试剂盒在2-8℃保存。杂交液临用前在45℃水浴中预热。 5适用仪器 ABI7000 PCR扩增仪、医用核酸分子快速杂交仪 6操作步骤 6.1 DNA提取操作步骤 6.1.1 取500ul临床样本，14000rpm离心5分钟，去上清液。 6.1.2 加入400ul溶液Ⅰ(事先在45℃水浴中预热)，混匀后沸水中煮15分钟。 6.1.3 稍微冷却后，加入400ul溶液Ⅱ，混匀，室温下放置2分钟，14000rpm离心5分钟，去上清（务必去干净，可14000rpm再次离心1-2分钟后去上清）。 6.1.4 室温放置2分钟，加入60ul溶液Ⅲ充分混匀溶解，取1ul样品做PCR检测（在做PCR之前,最好将提取的样品离心数分钟）。 6.2 PCR操作步骤 6.2.1 将已解冻的PCR Premix放在振荡器上振荡10 sec，放入离心机中点动；同时从冰箱中取出Taq酶管，不要振荡，放入离心机中点动。 6.2.2 然后将其再放入超净工作台内，将已融化了的PCR premix管、阴性对照（蒸馏水）管及Taq酶管插在冰块上保持其在低温条件下； 6.2.3 按照下表给出的不同反应数所需的PCR个组份的数量准备PCR Mastermix 成 分 用 量 Premix（μl） Taq酶（μl） 1人份 .25 0.75 2人份 4.83 1.58 3人份 .24 2.36 4人份 .65 3.1