第七章蛋白质分分离纯化和表征2009.ppt

第七章 蛋白质的分离纯化和表征;一、蛋白质的酸碱性质;等电点（pI）: 在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等电点（pI）。; 等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。 等离子点(isoionic piont): 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。 ;二、蛋白质的分子大小与分子量的测定;（二）渗透压法测定相对分子量;（三）沉降分析测定Mr;（四）凝胶过滤法测定Mr;（五）SDS法测定Mr;聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS）;1．蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100 nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： 双电层 水化层 a. 丁达尔效应 b. 布朗运动 c. 不能透过半透膜;2．蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 ① 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→ 蛋白 质脱去水化层。 优点：不引起蛋白质变性。 盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。;② 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）→脱去水 化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相 互作用。 条件：低温操作，缩短时间。 ③ 重金属盐沉淀法：当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) →生成沉淀。 ④ 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂—能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶 液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷→ 易与生物碱试剂, 酸根负离子反应→沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质;⑤　加热变性测定法;1.定义： 在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用(denaturation) 。 有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）。 一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。;; 化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、 生物碱试剂、尿素等 ; 旋光值改变 特性粘度增加 溶解度降低 扩散系数降低 结晶能力丧失 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点 则不一定沉淀 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化;变性蛋白质为什么能复性？ ;五、蛋白质分离纯化的一般原则;六、蛋白质的分离纯化方法;凝胶过滤法 ;;（二）利用溶解度差别的纯化方法; 盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。 有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主???原因是改变了介质的介电常数。 温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。 ;（三）根据电荷不同的纯化方法 电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为： 自由界面电 区带电泳;CH2=CH;Tris-Gly pH=8.3;聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS）;; 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。 若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目