讲稿 第24章 重组DNA技术2011.6.ppt

MCS有插入片段 MCS无插入片段 β-半乳糖苷酶 X-Gal 蓝色 Lac Z基因 MCS 载体上有β-半乳糖苷酶N端编码序列， 细菌染色体DNA有β-半乳糖苷酶C端编码序列 α-互补（蓝-白筛选） 4. 利用噬菌体的包装特性可初筛带有重组载体的克隆 λ噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对λ DNA大小有严格要求，只有重组λ DNA的长度达到其野生型长度的75%～105%时，方能包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑，而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。 （二）根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA 根据序列特异性进行筛选的方法包括： 限制性内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法等 1. 限制性内切酶法是根据限制酶切图谱筛选特定DNA 针对初筛为阳性的克隆，提取其重组DNA，以合适的限制性内切酶进行消化，经琼脂糖凝胶电泳便可判断有无DNA片段的插入及插入片段的大小。同时，根据酶切位点在插入片段内部的不对称分布，可用该方法鉴定DNA片段的插入方向；进而可用多种限制酶制作和分析插入片段的酶切图谱。 限制性内切酶图谱分析 目的序列插入载体会使载体DNA限制性内切酶图谱（restriction map）发生变化，如插入的目的序列中有其他限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。 2. PCR法可直接鉴定目的DNA的存在 利用序列特异性引物，经PCR进行扩增，可鉴定出阳性克隆。 如果利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。 3. 核酸杂交法常用于从文库中筛选目的DNA 常用方法是将转有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纤维膜上，细菌裂解后所释放出的DNA将吸附在膜上，将膜与标记的核酸探针杂交，通过检测探针的存在即可鉴定出含有重组DNA的克隆。该方法又称为菌落或噬斑原位杂交（in situ hybridizaiton）。根据核酸探针标记物的不同，可通过放射自显影、化学发光、酶作用于底物显色等方法来显示探针的存在位置（即阳性克隆的存在位置）。 菌落或噬斑原位杂交 Southern印迹（Southern Blot） 4. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法 测定核苷酸序列的方法主要有双脱氧链末端终止法和化学降解法，尤其以前者最为常用。 针对已知序列，通过测序可明确序列和阅读框的正确性；针对未知序列，可明确序列顺序，为进一步研究提供依据。 戊 糖 （RNA） 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 核糖(ribose) （DNA） 脱氧核糖(deoxyribose) DNA的序列测定 5′端 3′端 C G A DNA链末端合成终止法 DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸（或同一测序引物），然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 （三）亲和筛选法借助相关表达产物而筛选阳性克隆 亲和筛选法的前提是重组DNA进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法同上述菌落或噬斑原位杂交相似，只是被检测的靶分子换成了吸附于硝酸纤维膜上的蛋白质，检测探针换成了抗体/抗原或配体/受体。 Ab 通过以上分、择、接、转、筛五个步骤，便完成了一次DNA克隆过程。有时为了达到某种新的目的，需要对已克隆的DNA进行再次克隆，该过程称为亚克隆。 亚克隆的目的有多种，常见的有： ① 实现目的DNA的高效扩增 ② 表达目的DNA编码的蛋白质 ③ 对目的DNA序列进行分析 ④ 对目的DNA进行修饰（如突变、缺失、引入新的限制酶切位点等） ⑤ 获得单链DNA或RNA ⑥ 鉴定目的DNA是否具有某些特殊功能 亚克隆（subcloning）及其目的 第五节 常用的原核、真核细胞 表达体系 Frequently Used Prokaryotic andEukaryotic Expression Systems 一、原核细胞表达体系主要利用细菌表达外源蛋白 原核表达体系主要以细菌作为宿