PCR多聚酶链式反应.pptVIP

（四） PCR技术与DNA体内复制 定义： PCR (polymerase chain reaction ) 多聚酶链式反应 体外迅速扩增DNA片段的技术 已极少的DNA为模板，几小时复制出上百万分DNA拷贝 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果 72℃，1min 55℃，30s ９4℃，1min 最后一次 72℃，1min 55℃，30s ９4℃，30s 30次 － － 94°C，10min 第一次 延伸 复性 变性 循环数 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 （一）理论上DNA扩增数目的计算 三、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 2 、过程 ①稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③计算 ④计算 DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数） x 稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 比色杯 * * 多聚酶链式反应扩增DNA片断 内容提要 1、DNA的结构 2、DNA的复制 3、PCR技术 4、PCR技术的实验操作 一、基础知识 （一）DNA分基本结构 C、H、O、N、P 1、组成元素:___________________ 脱氧核苷酸 2、基本单位:____________ 3、脱氧核苷酸结构及连接 脱氧核糖核酸 DNA 分子又称：______________ C C C C C 1 2 3 4 5 C 5 C 3 C 3 C 5 H2O C 5 C 3 C 3 C 5 磷酸二脂键 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 5’端 3’端 DNA结构特点 5’端 5’端 3’端 3’端 例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，  乙DNA分子中，G和C占25％，A和T占75%， 哪一个稳定？ （二）DNA分子的特性 1、稳定性 在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来。 2、多样性 构成DNA分子的碱基对的数量不同 碱基对的排列顺序千变万化 例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？ 答：碱基对排列方式有44000种 3、特异性 不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的 原因 原因 （三）DNA的复制 2、时期 ________间期减数第____次分裂前的间期 3、场所 主要__________其次_______________ 4、模板 DNA母链 1、概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 有丝分裂 一 细胞核 线粒体、叶绿体 5、原材料 4种 脱氧核苷酸 6、基本条件 酶、ATP、原料、模板 7、复制过程 ① DNA的解旋 亲代DNA分子 ATP 、解旋酶 氢键断裂 部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② 引物的合成 作为DNA复制的起始点 ③ DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在引物