式细胞术系列之-DNA倍体和细胞周期分析.pptVIP

DNA倍体和细胞周期分析 DNA检测的常用术语 表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。 通常由G0/G1峰的CV来反映【 %CV=（SD/mean）x 100】。 影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。 可检测标本 新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。 冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织 常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。 蜡块包埋的标本需进行特殊处理 标本处理 染色过程 注意事项 1、需较长时间存放的标本可用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放； 2、一般组织或体液均为混合细胞成分，含有一定量的二倍体细胞，可以作为内参照。如分析的细胞来自纯肿瘤组织，应加入一定量的正常PBMC做二倍体对照； 3、每次分析前，用DNA质量控制试剂盒（如BD公司，Catalog No:349523），检测和评价仪器性能（如线性度、CV等）； 4、收集细胞用低速，应保证速度小于1000/秒，每个标本收取30000个细胞进行分析。 流式数据收集 1.流式细胞仪校准与设置： 打开仪器专用校准软件（如FACSComp)，用标准荧光微球（如CaliBRITE)进行校准； 在数据获取分析软件（如CellQuest)中，将FSC、SSC、FL2设为线性放大（Lin），DDM Param设为FL2。 2.荧光变异值（CV)调整： 用标准荧光微球检测FL2的线性荧光CV，若CV2%，提示仪器状态好，否则需重新校准仪器 3.检测对照细胞（一般选正常人PBMC作为标准二倍体细胞） 在CellQuest中画出FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图、FL2-A直方图； 通过调节电压，在FSC/SSC散点图中找到淋巴细胞，调节FL2-W/FL2-A电压，通过设门（R1），去除聚集细胞；在FL2-A直方图显示R1中的相比荧光峰，将二倍体荧光峰调至荧光通道为200道处，此CV值应5%，否则提示仪器状态不佳或标本处理不好 4.检测待测标本：用上述条件，检测待测标本，获取信息（可以根据具体情况调整电压，使FL2-A中二倍体峰值位于200道处） 结果分析 CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手工进行参数统计和计算； 推荐使用ModFit分析软件（分析如下：） 1、打开软件； 2、在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细胞，必要时可以设两个门。 3、在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图 注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。 * 细胞周期和DNA倍体分析的原理 G0/G1期DNA含量为2C S期细胞,DNA含量开始增加,2C G2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C 1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2、性细胞DNA含量为1C 3、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至4C 4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C 细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量 Diploid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23 G0/G1 S G2/M 1. 变异系数（Coefficient of Variation，CV） DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。 DI为1 意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。 倍体（Ploidy）：原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。 2. DNA指数（DNA index，DI）和倍体（Ploidy） DNA检测的常用术语 Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21 Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 %