雌激素受体及孕激素受体测定.docVIP

雌激素受体及孕激素受体测定 人乳腺癌组织中，有60～70％的组织存在雌激素受体(ER)及／或孕激素受体(PR)，其存在状况与诊断、治疗及判断预后有关。受体阳性者约60％用抗相应受体治疗有效；阴性者亦有10％的有效反应率。测定ER及PR的常用方法包括生物化学及形态学两大类；前者为对受体蛋白作定量测定，后者是观察受体在肿瘤组织，包括细胞内的分布及半定量测定。近年来在测定方面屡有改进，如单克隆技术、高效液相及细胞流式计数测定的应用等,尚未作为常规方法应用。 ? ??目前我国开展的生物化学方法有葡聚糖包裹活性炭液吸附法(DCC法)及蔗糖密度梯度超离心法(SDG法)；形态学方面有17-FE细胞化学法及免疫组织化学法(荧光法及酶联法)。由于各自条件不同，所用测定方法也不相同。为便于对资料进行对比分析，本章介绍这些方法，以便统一标准。 第一节? 生物化学法 ??? 一、葡聚糖包裹活性炭液吸附法 (DCC法) 该类方法系通过3H标记的雌激素与受体的特异性竞争结合来检测受体，包括DCC法（葡聚糖包裹活性炭液吸附法，Dextran Coated Charcoal）、SDG法（蔗糖密度梯度超离心法，Sucrose Density Graient Ultracontrifugation）、HPA（羟基磷石灰分析法，Hydroxylapatite）、鱼精蛋白沉淀法、琼脂糖凝胶电泳法（AGE）等，以DCC法和SDG法为经典方法。 ??? (一)测定原理? 在一定条件下，以氚标记雌二醇([3H]E2)为配体，与受体结合，以葡聚糖包裹活性炭液吸附游离的甾体激素，用液闪法测定与受体结合的标记激素含量，表示受体的量。以激素与受体结合的动力学方法计算受体含量。 (二)测定方法??? 1．? 标本处理：乳腺癌标本离体后立即分成两份，一份送病理检查，另份立即放入冰壶，送实验室作受体测定。剪除待测标本中肿瘤周围的各种正常组织及坏死组织后，以生理盐水冲洗，吸干后置液氮罐中保存，待测定。 ??? 2．? 制备上清液：全过程均在0～4℃下进行。? ??? (1)组织粉碎：称湿重后，剪成碎块或用Auto-pulverizer于冰冻下粉碎。 ??? (2)制备匀浆：以Polytzon PT-10-ST匀浆器(或玻璃匀浆器)，用1：10(重量：体积)、pH7.4的TED缓冲液(0.0l mol／L Tris-HCl，0.0015 mol／L EDTA，0.5 mmol／L 二硫苏糖醇DTT)，匀浆3次，每次5秒，间隙15秒。 ??? (3)离心：匀浆液以105，000×g超速离心1小时(或7000×g低温高速离心15分钟)，得上清液备用。 ??? (三)雌激素受体测定 ??? 1．? 方法与步骤?? ??? (1)两列试管分别加入一系列不同浓度的[3H]E2? 50 μ1，使反应终浓达0.032，0.063，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 nmol／L共7个浓度，分4组。 ??? (2)第一列试管(共2组)为结合管，分别加入50μ1TED缓冲液，以测定其总结合量；第二列试管(共2组)为对照管，分别加入200倍于[3H]E2 浓度的己烯雌酚(DES)溶液，抑制[3H]E2 与ER结合，以测定其非特异性结合量。 ??? (3)每管各加入150μ1乳腺癌上清液，每管均设重复管。 ??? (4)各试管均置0～4℃冰箱18～20小时。 ??? (5)每管加500 μl DCC液(含0.25％活性炭，0.025％葡聚糖和含10％甘油的0.0lmol／L Tris-HCl、pH8.0的缓冲液)，将分离游离的[3H]E2、DCC液用电磁搅拌器搅拌，吸取混匀的试管内容物，静置15～30分钟后3000r／min离心10分钟。??? ??? (6)取上清液0.5μl 置计数瓶内，加6μl甲苯闪烁液(4g的PPO和0.59的POPOP溶于1000μl甲苯)，2小时后以液体闪烁计数器测定其每分钟计数。 ??? 2．? 结果处理：以各管的总结合量减去相应管内的非特异结合量，即为各管的特异结合量，以Scatchard法作图，便可求出Kd值和受体含量(图10-1，2)。求得ER量为105 fmol／mg蛋白，Kd值为3.4×10-10mol／L，将直线延伸达X轴，其交点即为其结合量。计算时应考虑到机器效率、[3H]E2比活性及衰变等因素。结合量以fmol表示。用Lowry或考马斯亮蓝法测定上清液内蛋白质含量，最终各乳腺癌组织内ER含量以fmol／mg蛋白表示之。 ? 3． DCC单点饱和法测定ER：由于用常规七点DCC法所需组织量多，操作、计算费时，如同时测定ER及PR量，所需标本量更多，易受标本量限制而不能完整测定。单点DCC饱和法比较省时，节约试剂，易被临床接受作为常规测定方法。通常用[3H]