厌氧真菌内切–β–葡聚糖酶基因在里氏木霉中的-高校化学工程学报.PDFVIP

第25 卷第4 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.4 Vol.25 2011 年 8 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Aug. 2011 文章编号：1003-9015(2011)04-0637-06 厌氧真菌内切–β–葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达 金 欣, 夏黎明 (浙江大学 化学工程与生物工程学系, 浙江 杭州 310027) 摘 要：里氏木霉(Trichoderm reesei)是重要的纤维素酶生产菌，为了显著提高其产酶性能，拟利用分子生物学技术构 建高产的基因工程菌株。将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切- β -葡聚糖酶基因af 2 置于里氏木霉纤维二糖水解酶I 强启 动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1 之间，并进一步以pCAMBIA1300 为载体骨架，构建成含潮霉素B 抗性标记 的重组质粒pCB-hF 。以里氏木霉ZU-02 为宿主，采用优化的根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入经萌发处理的 分生孢子。以潮霉素B 为抗性标记初筛到318 个阳性转化子，进一步接种到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的筛选培养 基上，复筛到8 株生长较快的转化子。以重组转化子基因组DNA 为模板，分别进行PCR 检测，均可获得目的基因片 段，表明厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已整合到里氏木霉的染色体DNA 上。在摇瓶条件下，分别对 8 个重组转化子 进行产酶试验，获得3 个高产内切- β -葡聚糖酶活力的转化子。发酵培养96 h 时，发酵液的内切-β-葡聚糖酶活力最高 可达到 126.3 IU⋅mL− 1 左右，是出发菌株的4.23 倍。研究结果表明：厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已在里氏木霉细胞 中得到高效表达并实现了胞外分泌。 关键词：厌氧真菌；内切–β -葡聚糖酶；基因克隆；里氏木霉；胞外表达 中图分类号：Q556.9 文献标识码：A Recombination and Expression of an Anaerobic Fungus Endo–β-Glucanase Gene in Trichoderma Reesei Cells JIN Xin, XIA Li-ming (Department of Chemical Engineering and Bioengineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China) Abstract: Trichoderma reesei is a good cellulase producer. In order to improve its enzyme production, molecular biology technology was adopted to obtain recombinant strain with high yields in this study. An optimized anaerobic fungus endo–β-glucanase gene af 2 was inserted between T.reesei strong promoter Pcbh1 (including secret