免疫组化概论.ppt

⑵ 所有切片均呈弱阳性反应 　① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了 　② 缓冲液配制中未加氯化钠和pH不准确，洗涤不彻底 　③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长 　④ 抗体温育的时间过长 　⑤ H2O2浓度过高，呈色速度过快 　⑥ 粘附剂太厚 ⑶ 所有切片背景过深 　① 未用酶消化处理切片 　② 切片或涂片过厚 　③漂洗不够 　④ 底物呈色反应过久 　⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血 　⑥ 使用全血清抗体稀释不够 　　⑷阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反 应，固定和处理不当是最常见的原因。 　　对于阳性结果的定量判断常规办法是根据呈色深 浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、++、+++ 等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，使免 疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。 另一种先进的免疫细胞化学计量分类技术——流式细 胞光度计技术。 用于免疫细胞化学的 有关细胞和组织学技术 　　一、细胞和组织 　　免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗 体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾 病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组 织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的 生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各 种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好 的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此， 细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占 有十分重要的位置。 　　2. 一个抗体分子有两个抗原结合点 (称两价) 　　在一个抗原分子上则可有许多个结合点 ( 称为 多价 )。 抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比 例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原 与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的 条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可 见的反应。 　　3. 主要的血清学反应有3个类型 　　即凝集反应、沉淀反应和有补体参 加的各种血清学反应。 　　五、补体系统 　　补体系统(Complement system) 是存在于人和动物 正常血清中，具有酶活性的一组复杂的血清蛋白。由球 蛋白、碳水化合物、与磷脂结合而成，约占血清球蛋白 总量的10%，不耐热，加热56℃经30min即被灭活。补 体参与多种抗原抗体反应，导致细菌、红细胞等溶解。 但此作用不是特异性的，即能与任何抗原抗体的复合物 结合而发生反应。近年的研究表明补体不仅是机体自身 稳定和保护性反应的重要物质之一，而且还参与许多免 疫病理的损伤机制。 　　补体系统由9个成分11种血清蛋白质组成，常以 符号“C”表示。根据其作用顺序分别命名为 C1、C2、 C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9。其中C1又由 3个亚 单位所组成，即C1q、C1r和C1s。C1—~C9 —代表活 化的补体成分。 所有补体成分均为大分子蛋白质； 除C1q外，皆以不活动形式存在于血清中。 　　补体的各种成分由体内不同部位合成。C1由胃 肠道上皮细胞合成，C2 与C4 由巨噬细胞合成，C3 主要在肝脏合成，C6、C9也可能在肝脏合成。 　　当因某种原因补体被激活时， 补体成分便按两 种激活途径C1激活途径和C3激活途径，按一定的顺 序呈现连锁的酶促反应， 参与机体的防御功能和维 持自稳状态； 亦可作为一种介质或效应物质参与机 体的免疫病理过程。 免疫细胞化学的 分类和有关技术概述 　　一、分类 　　根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫 荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白 技术，免疫金—银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技 术，免疫电子显微镜技术等。近些年来，核酸分子原位 杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针， 和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化 学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂 和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制 备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观 察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。 　　二、抗体的制备和配制 　　㈠　抗体的制备 　　这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备 具有很高特异性和敏感性的高效价抗体。目前国内 外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接 应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗 体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质， 能够自制较好。 　　㈡　抗体的配制 　　包括抗体的贮存液和抗体使用液的配制 方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗 血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或 腹水。 　　1. 抗体贮存 　　获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的 抗体效价，将其分装，可每10ul或 100ul/支分 装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入 -20℃~-40℃冰箱中保存备用, 一般可保