修美乐报告课件.pptx

全人源单抗-修美乐Contents:一、研发背景1993年巴斯夫旗下诺尔药业英国剑桥抗体技术公司CAT Ⅱ期临床试验证明有疗效 继续研发、建立营销渠道需要很大投入 噬菌体展示技术→筛选得到某一特定抗原表位的TNF抗体→人源化加工处理→得到第一个完全人源化抗TNF-α单抗药物D2E7巴斯夫回归化学主业 剥离诺尔药业2000年，雅培以69亿美元收购诺尔药业及其所有上市和在研产品。一、研发背景雅培耗资 10 亿美元以扩展该药的新适应症：银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、斑块型银屑病、多关节型幼年特发性关节炎修美乐可以预见适应症还将继续拓宽，2015年已经分别向FDA和欧洲药管局（EMA）提交了该药物用于化脓性汗腺炎的新药上市申请。2012.10，美国 FDA 批准了该药的第七个适应症: 溃疡性结肠炎。这使得修美乐将在慢性病领域发挥作用，并影响美国的 62 万患者。修美乐在溃疡性结肠炎这一领域的使用，为其增加额外的 5 亿甚至更多的销售额。2003 年 1 月首次在美国上市，美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗中到重度类风湿关节炎一、研发背景2015年的销售额更是达到了140.9亿元。新药层出不穷，修美乐能够荣登全球畅销药之首的主要原因是：产品过硬、适应症广、受众群大，能解决临床上的迫切需求。2012年起，修美乐就以94.8亿的成绩稳坐全球药物销售排行榜榜首。2013年，雅培宣布进行拆分，修美乐被划归为专注于生物制药研发的新公司艾伯维旗下二.分子基础以及构建全人源抗体制备的四种途径:三.通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。四.通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。二.分子基础以及构建阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，阿达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，κ链恒定区序列，包括1330氨基酸残基，分子量大概有148kD。该抗体对hTNF-α具有很高的亲和性（Kd=10-8M or less）和比较低的解离速率（Koff=10-3/s or less)，阻止其与细胞表面的TNF受体 p55，p75 位点结合，能够使体内表面TNF 表达的细胞裂解，导致TNF 水平降低。能够中和hTNF-α的活性包括hTNF-α诱导的细胞毒性和细胞活化作用。关于D2E7的结合特异性，其可与各种形式的hTNFα结合，包括可溶性hTNFα，跨膜hTNFα和与细胞受体连接的hTNFα。D2E7不会与其它细胞因子特异性结合。二.分子基础以及构建D2E7的一级结构轻链可变区序列二.分子基础以及构建重链可变区序列二.分子基础以及构建重组人源抗体的筛选1.建立人源scFV噬菌体抗体库。其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的mRNA经噬菌体展示技术得到的。2.为了分离与hTNFα具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对hTNFα具有高亲和力的鼠源抗体（MAK 195）用抗原表位印记（epitope imprinting)的方法选择对hTNFα具有亲和力的人源序列。3.选好了VH和VL片段之后，“mix and match”实验用来筛选合适的VH和VL配对。4.获得编码合适抗体的DNA序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达。 二.构建过程人源序列的突变通过标准方法获取。例如:PCR介导的突变（即通过引物使突变的核苷酸插入）或者定点突变获取编码抗体轻链和重链可变区的DNA片段经突变后编码D2E7或者D2E7相近抗体的氨基酸序列。通过重组DNA技术进行下一步操作抗体的表达表达载体的构建如何获取？这可通过PCR对人源轻链和重链的修饰和扩增获得。例如为了获得D2E7或与其相近抗体的编码重链可变区的DNA片段，人VH基因的VH3基因家族中某一基因（DP-31)通过PCR进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人VL基因的VκI家族中的某一基因（A20）通过PCR进行扩增。如何重组？例如把可变区序列转变为完整的抗体，Fab或者scFV片段。即把轻重链可变区序列分别与其对应的恒定区结合，重链恒定区可以是IgG1-4、IgA、IgD、IgM和IgE，最好是IgG1和IgG4的恒定区。轻链恒定区可以是κ和λ链恒定区，最好是κ链恒定区。载体构建注意事项：对于哺乳动物的宿主细胞表达更倾向于使用病毒元件，从而有利于其在哺乳