免疫组化、免疫荧光、流式细胞术与应用比较及常见问题分析.pptVIP

流式细胞仪工作原理图 流式细胞术实验过程 细胞悬浮液制备（浓度为1～5×106个/ml） 细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等） 细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等） 封闭（3%BSA-PBS等） 一抗孵育 荧光二抗孵育 流式细胞仪分析 免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析 宋砚明 song_yanming@ 免疫组化（IHC）的应用介绍 免疫荧光（IF）的应用介绍 流式细胞术（FC）的应用介绍 IHC、IF、FC区别与联系 免疫组织化学原理及特点 利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。 免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC） 细 胞 抗原 一抗 二抗 辣根过氧化物酶（HRP） 3，3-二氨联苯胺（DAB）显色剂 棕褐色络合物 IHC反应原理示意图 组织切片/芯片制作 免疫组化流程示意图 2. SP法 原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后，生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记的链霉亲和素复合物。 特点：该法孵育时间短（通常为10min），灵敏度高以及低背景染色等特点。 1. SABC法 原理：SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。 3. Polymer酶标二抗法 原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具有很高的信号放大作用。 特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进行内源性的生物素封闭。 IHC二抗原理及选择 4. 直接酶标二抗法 该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。 IHC常用酶标二抗原理示意图 2. AEC显色法 产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC显色原和与之配套的稀释液。 试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B） 1. DAB显色法 产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’-diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B） 3. BCIP/NBT显色法 产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、western blot、northern blot和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色物质。 试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑 IHC显色方法原理及选择 4. BCIP/INT显色法 产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、western blot、northern blot和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐色物质。 试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑 免疫组织化学结果分析 2.非特异性显色 石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建