免疫组织化学常用技术方法大全课件.ppt

2. 胶体金的稳定性 溶液的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒的倾向。 三、在免疫细胞化学中的应用 （一）免疫金染色 1. 免疫金法 1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金法（immunogold staining, IGS） SPA-胶体金技术（PGA技术）可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位，是一种较为理想的免疫电镜技术。 SPA-HRP用于间接法的操作步骤： ● 切片脱蜡 ● 第一抗体，37℃，孵育30min或4℃，24～48 h ● PBS 冲洗， 5min × 3次 ● SPA-HRP（1:100 ～ 1:400）， 30 min ● DAB-H2O2显色 ● 复染、封片、观察、记录 第四节 凝集素 凝集素（lectin）是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，因其能凝集红细胞（含血型物质），故名凝集素。 植物凝集素 刀豆蛋白A （ConA） 麦胚素 （WGA） 花生凝集素 （PNA） 大豆凝集素 （SBA） 一、基本原理 生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特点在于它们能识别糖蛋白或糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳水化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。 麦芽素 N-乙酰糖胺 菜豆凝集素 N-乙酰乳糖胺 刀豆素 α-D-吡喃糖基甘露糖 凝集素具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物质结合。 二、操作程序 ■ 直接法：标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。 1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素标记物（100 μg/ml），室温，30min； 3. 荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察； 4. PBS洗涤，5min × 3次； 5. 显色、封片、观察、记录。 ■ 间接法：将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将示踪物质标记在抗凝集素抗体上。 1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 μg/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min × 3次； 4. 标记的抗凝集素抗体（1:100），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min × 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。 ■ 糖-凝集素-糖法：过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，再与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖基-凝集素-糖基的结合物。 1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 μg/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min × 3次； 4. HRP标记糖基（10 μg/ml），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min × 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。 三、应用 ● 作为细胞分化和成熟的标记 淋巴细胞的分群 小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的 T 淋巴细胞，值得进一步研究。 ● 作为细胞特殊类型的标记 研究人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。 乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应，肌上皮细胞呈PNA阴性反应。 刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。 ● 肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。 凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标记，肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。 第五节 链霉菌抗生物素蛋白检测系统 链霉菌抗