基因工程常规技术-分子杂交课件.pptVIP

间期FISH 中期FISH * * Multi-FISH * 基因芯片 基因芯片(Gene chip, DNA chip)，又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。 * * * 核酸分子杂交/分子杂交 蛋白质分子杂交 * 核酸分子杂交：具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针（probe）。 * 原理 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 * 核酸杂交 碱基互补配对原则 * + * 核酸探针/探针probe 一小段已知核酸序列，能特异性地探测带某一特定序列的DNA或RNA分子，可用放射性同位素或其他标记物标记，与样品中互补序列发生特异的碱基配对结合，然后用放射自显术或其他显示系统检测出来，广泛用于分子杂交技术。 * ACCGTAGCTAGGGTTCACACAAATGGCCCGTA CAAGTGTGTTT * 放射性同位素(32P, 3H, 35S, 125I, 14C) 非放射性标记物 生物素 地高辛 荧光素 酶 * 探针分类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针：是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称 * 反应介质（按待测核酸是否固定在固相支持物上分）：液相杂交、固相杂交 常用固相支持物 硝酸纤维素膜(NC膜，nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane) * 正向杂交 将多个待测序列固定在膜上，用标记的探针与固定在膜上的待测序列进行杂交。一张膜可检测多个样品。 反向杂交 将多种探针固定在膜上，用标记的待测序列与固定在膜上的探针进行杂交。一次杂交反应可以确定多种基因型 。 * * Southern blot DNA印迹杂交技术，由英国人Edwin Mellor Southern于1975年首先设计出来的，故称Southern blot。 Southern blot：使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。 * * 主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 * Southern blot 筛选结果 * 主要应用： 遗传病诊断 　　 DNA图谱分析 　　 PCR产物分析 * Northern blot RNA印迹杂交技术：与Southern blot杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，被趣称为Northern杂交。 将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上，从而用于杂交反应以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达情况。 * 特点： 基本原理和过程与Southern blot基本相同 鉴别RNA 探针可用DNA或RNA片段 待测样品为总RNA或mRNA * 变性胶：不能用碱变性 * * 应用 检测不同组织、器官、生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。 癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降 器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升 检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。 * 原位杂交技术 原位杂交（in situ hybridization，ISH）：用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。 * 例：菌落原位杂交 对应的菌斑/噬菌斑位置不变，可直接找出阳性菌落 * 荧光原位杂交（FISH） 荧光原位杂交（FISH, Fluorescence in Situ Hybridization） 利用目标核酸的互补序列的非同位素标记核酸探针，依据碱基互补配对原理，再通过荧光亲和素免疫组化检测体系，在组织切片、细胞间期核及染色体等标本上，对待测核酸进行定性、定位及相对定量分析的一种方法。 * * ?????? ?? ???? ????? ???.