表达绿色荧光蛋白基因地花鲈胚胎干细胞株地建立及其体外分化.PDFVIP

叶寒青等 :表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化 表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化① 叶寒青② 　陈松林 ③ 　刘 　洋 　沙珍霞 ( 中国海洋大学海洋生命学院 　青岛 266003) ( 中国水产科学研究院黄海水产研究所 ,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室 　青岛 266071) ( ) 摘 　要 　以带有绿色荧光标记的基因 pCMVEGFP 为报告基因 ,用 Genejammer 、Genejuice ( ) 和 Metafectene 三种脂质体介导花鲈胚胎干细胞 LJ ES1 的基因转移。实验发现 , Genejam mer 介导的细胞转化效率最高 ,高达 273 % ,其余分别为 121 %和 53 % 。转移绿色荧光 ( ) 蛋白 GFP 基因的LJ ES1 细胞经过药物筛选和单克隆化培养 ,获得了表达 GFP 基因的阳 性克隆细胞株 ,经 PCR 对 GFP 阳性细胞株的基因组DNA 及提取的 RNA 扩增 ,获得了目的 条带 ,证实了 GFP 基因已经整合到LJ ES1 细胞的基因组中 ,并获得了正常的表达。通过体 外诱导 ,GFP 阳性细胞能够分化为神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等 ,用悬滴法培养获得 了 GFP 阳性细胞的拟胚体 ,证实了经过长期的药物筛选后 ,LJ ES1 细胞仍然保持着发育的 多能性。这一研究 ,为进一步利用海水鱼类胚胎干细胞进行遗传操作及基因工程的研究 提供了方法上的探索。 关键词 　脂质体 , 绿色荧光蛋白 , 胚胎干细胞 , 转化 , 体外分化 脂质体法目前广泛应用于真核细胞转化 ,其介导的 0 　引 言 细胞基因转移简单易行 ,并且有实验证实其适合于 ( ) [11 ,12 ] 胚胎干细胞 ES 细胞 是从早期胚胎中分离出 鱼类细胞的基因转移 。本文应用三种脂质体 来的全能性细胞 ,经过体外的培养和遗传修饰 ,仍然 (Genejuice , Genejammer 和 Metafectene) 介导绿色荧 ( ) 具有分化的全能性。它们经显微注射可被引入未受 光蛋白基因 pCMVEGFP 作为报告基因转入花鲈胚 精卵中 , 并发育成包括生殖系在内的各种组织[1 ] 。 胎干细胞 ,然后使用药物筛选 ,获得了表达 GFP 的 在小鼠上 ,利用胚胎干细胞进行基因打靶的技术已 阳性单克隆细胞株 ,并对 GFP 基因在花鲈胚胎干细 经建立 ,通过胚胎干细胞介导获得了多种基因敲除 胞株中的整合及表达进行了鉴定 , 同时在体外将 的小鼠[24 ] 。在小型模式鱼类 ———青　和斑马鱼上 , GFP 阳性的花鲈胚胎干细胞诱导分化为神经细胞、 通过胚胎干细胞介导也获得了报告基因的嵌合 肌肉细胞、成纤维细胞等 ,通过悬滴法培养 GFP 阳 体[5 ,6 ] 。本实验室目前已经建立了海水鱼类花鲈、 性的花鲈胚胎干细胞获得了拟胚体 ,证实了 GFP