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DNA简单重复序列基因分型新方案 　　摘要：随着大规模测序技术的不断发展，测序成本降低，各种生物的基因组序列已逐步完善，重测序工作成为基因多态性研究中非常重要的方法。它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性，广泛应用于多种疾病的检测和鉴定等。但是，当重测序过程中遇到简单重复序列时，往往会出现峰谱图的滑移现象，使测序结果不准确。本研究利用荧光标记引物定向扩增包含重复序列的片段，结合ABI 377 DNA自动测序仪进行检测重复单位，结果表明，该方法可以准确无误的检测出重复序列的重复次数，是对重测序工作中的重复序列分型技术的一项重要补充。 关键词：重复序列；重测序；荧光标记引物；ABI 377 DNA自动测序仪 中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0061-3 基金项目：国家自然科学基金 0 引言 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。当前，“重测序”在动植物育种研究广泛应用。据了解，研究人员运用新一代测序技术对17株野生大豆和14株栽培大豆进行了全基因组重测序，完成世界上首次对野生大豆和栽培大豆全基因组进行大规模遗传多态性的分析。另外，科学家通过40个家蚕突变品系和中国野桑蚕的全基因组序列，绘制完成了世界上第一张基因组水平上的蚕类单碱基遗传变异图谱。近年来，包括人、牛、鼠等哺乳动物， 家蚕、蜜蜂等昆虫， 拟南芥、水稻等植物， 以及流感嗜血杆菌等微生物越来越多生物物种的基因组序列被测定，针对生物多样性的研究也越来越普遍，重测序工作将得到更广泛的应用。 重测序技术是将新序列与已知的对照样本中得到的一个或者多个DNA序列比较的方法，用来鉴定DNA序列中的突变/变异，从而检测到与重要科学问题相关的突变/变异，在临床诊疗，疾病检测等方面都具有重要作用。但是，在重测序的过程中也存在很多问题，由于Sanger（桑格）双脱氧链终止法测序的原理是聚合酶链式反应，即PCR反应，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。当序列中出现重复序列时，对于采用双脱氧测序法来说，由于重复序列的重复次数繁多，易造成结果峰谱图滑移等问题，造成数据的不准确。目前研究表明，不论是在低等原核生物还是高等真核生物的基因组中， 都存在着一定比例（1%～77%）的重复序列，因此， 测定重复序列， 尤其是高度重复序列是目前重测序中的一个疑难问题。 荧光标记引物，是对引物进行荧光标记，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物。利用荧光引物进行扩增的PCR产物，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳获得相应图谱，再通过genemap3.0软件分析，得到准确的PCR产物长度大小。本文通过利用荧光引物特异性扩增含重复序列的目的片段，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合测序技术验证，探索了一种简单、快速鉴定个体间重复序列差异的方法，不失为一种准确性高，重复性好的重测序实验方法。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样本 11个不同地区中国野生小家鼠DNA样本（嘉定3，崇明41，崇明31，崇明25，松江5，金山7，金山11，金山13，南汇，浦东5，浦东3）以及1个实验室小家鼠品系C57BL/6J（九亭实验动物中心购买）样本DNA。 1.1.2 引物合成 用于扩增特异区段的PCR引物序列如表1所示。荧光引物YG所带荧光为蓝色，扩增片段内含4碱基的重复序列，荧光引物lan所带荧光为蓝色，扩增含单碱基重复序列的野生小鼠样本，荧光引物lv所带荧光为绿色，扩增含单碱基重复序列的实验室对照小鼠样本。由上海生工有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 DNA抽提 采用酚氯仿法抽提小鼠DNA，依照酚氯仿抽提实验说明书。 1.2.2 PCR扩增反应 PCR反应体系（10ul）包括：ddH2O 5.3ul，10×PCR buffer（含15mM Mg2+）1ul，25mMMg2+ 0.6ul（3mM），dNTPmix（各2mM）1ul，primer 1ul（浓度0.02mM），HotStarTaq DNA Polymerase（5 units/ul），0.1ul，Template DNA 1ul（3～5ng/ul）。试剂由上海生工有限公司提供。PCR反应程序：①95℃ 15min； ②94℃ 30s； ③60℃ 45s ；④72℃ 1min；重复②-④共35个循环； ⑤72℃ 10min → 25℃ forever。 1.2.3 测序分析 将所得