叶用莴苣热激蛋白基因lshsp70-2711的克隆及高温-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2017,50(8):1486-1494 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.012 叶用莴苣热激蛋白基因 LsHsp70-2711 的克隆及 高温胁迫下的功能分析 李雅博，李婷，韩莹琰，范双喜 （北京农学院植物科学技术学院，北京 102206 ） 摘要：【目的】通过克隆 Hsp70 相关基因，并利用 VIGS 分析叶用莴苣热胁迫下 Hsp70 表达量和形态变化， 为解析热激蛋白基因 Hsp70 在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及 RACE 技术， 获得叶用莴苣热激蛋白 LsHsp70-2711 的 cDNA 全长序列，利用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析该基因在不同 温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异，确定基因和高温的相 关性。根据 VIGS 技术，构建 pTRV-LsHsp702711 瞬时沉默载体，转化农杆菌 GV1301，注射法侵染叶用莴苣叶片， 三周后经 PCR 鉴定得到阳性植株。对照组和阳性组在基因表达和形态上进行对比，对照植株和阳性植株热胁迫 和干旱处理后再次分析 LsHsp70-2711 的表达特性，观测形态变化。【结果】LsHsp70-2711 cDNA 全长为 2 226 bp， 开放阅读框为 2 154 bp，编码 718 个氨基酸，与拟南芥（NP_187864.1）、番茄（NP_001266213.1）、水母雪 莲花（AAB99745.1）等物种的 Hsp70 同源性达到 80%以上，证明此基因属于 Hsp70 家族。根据 qRT-PCR 结果， 高温胁迫下该基因在两个品种中的表达均上调，在耐热品种中总体表达水平均高于热敏品种，耐热品种 LsHsp70-2711 的表达量最大值出现在 42℃、60 min，37℃、60 min 时热敏品种基因表达量达最大值，且在 42℃高温下热敏品种‘P-S11’中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制，而耐热品种‘G-S59’则能长时间保 持较高的表达水平，此结果和田间两品种间耐热差异表现相符合。亚细胞定位显示，LsHsp70-2711 主要在细胞 质中。将构建好的载体侵入叶用莴苣，鉴定后获得阳性植株。由定量 PCR 结果可知，未进行胁迫处理的阳性植 株与对照株相比，LsHsp70-2711 表达量下降，茎长明显增长。热胁迫和干旱处理后的阳性植株 LsHsp70-2711 表达量显著低于对照植株，高温处理对 LsHsp70-2711 的影响大于干旱胁迫。【结论】LsHsp70-2711 属于 Hsp70 基因家族，其与叶用莴苣耐热性相关。研究结果为解析叶用莴苣热激蛋白 LsHsp70-2711 在叶用莴苣高温抽薹方 面的功能提供了理论支持。 关键词：叶用莴苣；Hsp70；基因克隆；高温胁迫；基因沉默 Cloning and Function Analysis of Heat-Shock-Protein LsHsp70-2711 Gene Under High Temperature Stress in Leaf Lettuce (Lactuca sativa L.) LI YaBo, LI Ting, HAN YingYan, FAN ShuangXi (College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206) Abstract: 【Objective 】Through cloning of genes related to Hsp70, and using VIGS to analyze Hsp70