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人FGF―9慢病毒表达载体构建、包装和鉴定 　　[摘要] 目的 构建人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）慢病毒表达载体，鉴定其表达，并对慢病毒载体进行包装，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。 方法 PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体，连接产物转化感受态细胞，PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞，荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达，Western-blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病毒，RT-qPCR测定滴度。 结果 PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒；感染293T细胞后，荧光显微镜观察到eGFP，Western-blot检测到FGF-9融合蛋白表达；三质粒共转染293T细胞获得慢病毒，测其浓度为2×108 TU/mL。 结论 成功构建人FGF-9慢病毒表达载体，可在293T细胞中表达，并包装成慢病毒，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。 [关键词] 成纤维细胞生长因子-9；慢病毒；肿瘤 [中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（c）-0016-04 人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）是人成纤维细胞生长因子的家族成员之一，最初发现于人类神经胶质瘤细胞[1]，定位于人13qll-q12t染色体[2]，长约34 kb，包括3个外显子和2个内含子；该基因编码区有627个脱氧核苷酸，编码208个氨基酸。许多研究表明，FGF-9异常表达，可导致多种疾病的发生，如子宫内膜异位症及肿瘤[3]。Todo等[4]研究了4株人胶质瘤细胞系，发现FGF-9对其中3株有促增殖作用，这一作用的强弱与FGF-9的剂量正相关。Granerus等[5]在对畸胎瘤细胞系的研究中发现，FGF-8与FGF-9均可促进细胞倍增，但二者的作用效力不同：加入同等量的FGF-8与FGF-9，后者可引起细胞骤增，而前者效果相对较弱。Ueng等[6]研究摩托尾气部分提取物（MEP）的促癌机制，在细胞水平发现MEP可使肺癌细胞系CL5中多种蛋白表达水平改变，其中包括FGF-9表达上调；在动物水平，大鼠每天吸入2 h摩托尾气，持续吸入4周，其肺组织中FGF-9表达增加。 慢病毒载体现已广泛用于基因稳定转染表达及shRNA介导的基因敲除技术。其优点为[7]：①可将携带的基因稳定持续转染至宿主基因组；②可转染分裂及未分裂细胞；③转染后无病毒蛋白复制；④可携带复杂基因信息；⑤安全整合；⑥载体系统构建相对较简单。故在基因研究及基因治疗领域中，慢病毒逐渐受到青睐。 本研究旨在构建人FGF-9慢病毒表达载体，鉴定其表达产物，并对慢病毒载体进行包装，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。 1 材料与方法 1.1 材料 大肠杆菌菌株DH5α、293T慢病毒包装细胞为本实验室保存；含FGF-9片段的293T慢病毒包装细胞质粒购自Clontech公司；pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP载体、结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0购自上海吉凯基因化学技术有限公司；其余试剂均为进口或国产化学分析纯。 PCR仪购自Applied Biosystems公司；positive clone测序仪购自美季生物技术公司；荧光显微镜购自奥林帕斯公司。 1.2 方法 1.2.1 目的基因PCR扩增、酶切 依据FGF-9基因信息设计PCR引物，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。引物序列：5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCTCCCTTAGGTGAAG-3’（上游），5’- TCCTTGTAGTCCATACCGCTTTGGCTTAGAATAT CC-3’（下游）。以含FGF-9片段的质粒为模板，PCR钓取目的基因，电泳检测。回收预期668 bp大小PCR产物片段。目的基因PCR产物双酶切。 1.2.2 重组质粒构建 pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP载体AgeⅠ酶切，目的基因PCR产物交换入线性表达载体，将连接产物转化到感受态细胞。PCR鉴定长出的克隆。阳性克隆基因测序。 1.2.3 目的基因过表达载体检测 处于对数生长期的293T细胞胰酶消化，制成细胞悬液，接种于24孔细胞培养板中。依据Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂使用说明书进行转染操作。转染24 h后，观察质粒上荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达。转染36 h后，收集细胞，Wes