RNA提取_RT-PCR技术专题.ppt

RNA相关知识及提取原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南 RNA提取的基本方法——裂解原理不同 盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 β-巯基乙醇变性蛋白 RNA提取的基本方法——吸附方法不同 RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南 样品前处理——实验材料的选择 细胞裂解－－释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRNzol、TRNzol－A＋总RNA提取试剂 RNA纯化与获得－－ 纯化要求 实验举例及注意事项 使用试剂（以TRNzol－A＋为例） 使用试剂盒（以RNAprep pure试剂盒为例） 试验材料： Hela cell/106 实验方法： TIANGEN公司 TRNzol-A+ A公司同类产品 试验结果： 得率：TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高 纯度： 经TRNzol-A+纯度较高， 无明显DNA、蛋白残留 前处理 试验材料：大鼠肝脏/10mg 实验方法： TIANGEN公司 RNAprep pure Kit A公司某柱式RNA提取试剂盒 试验结果： 得率：RNAprep pure 得率比A公司产品高15％左右 高纯度：纯度较高，且无盐份残留 RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南 一些特殊组织的RNA提取 纤维组织 蛋白/脂肪含量高组织 核酸/RNase含量高组织 植物组织/真菌组织 RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南 RNA的评价与鉴定 RNA的保护－－RNA的不稳定性 组织破碎 细胞裂解 实验人员 保存过程 RNAsafe 后续实验 RNasin RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南 模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA 引物：随机引物，Oligo dT，基因特异性引物(GSP) 反转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase 逆转录酶的选择 AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃。 MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃或42℃。 Quant Reverse Transcriptase 全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通读效果好，质量稳定，最适37℃。 RT引物的选择 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA Oligo(dT)：适用于具有PolyA尾巴的RNA。 GSP: 与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列 已知的情况 分离高质量RNA 使用高活性的逆转录酶 提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染 彻底破碎 多次氯仿抽提 减少处理量，多次氯仿抽提 多次氯仿抽提，特殊试剂 纯度（ OD260 /OD280 ）： 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍） OD260 /OD280 1.9 说明有蛋白污染 OD260 /OD280 ＝ 1.9 ～2.1说明纯度很好 OD260 /OD280 2.1说明有部分降解 得率 紫外分光光度计进行测量； Yield＝ OD260×稀释倍数×40ng/ul 电泳检测 1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3 ul M 1 2 M 1 2 DNA残留 蛋白残留 内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活 RNA的保护－