PCR技术及其应用 - 实验动物 实验动物信息.pptVIP

目 录 PCR的反应原理 PCR的类型和应用 PCR示例 PCR1 PCR2 Main　 Run Enter List Edit File Lid 运行已有程序 已有程序菜单 删除已有程序 新建反应程序 编辑已有程序 热盖关闭调节 Enter Enter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=# Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube 输入文件名,满8个字符自动生成程序名,不满8个字符时用#终止 BLOCK:屏幕显示样品台温度(样品台温控方式) Sim-Tube:屏幕显示反应液温度(模拟管温控方式) Enter PCR1Segment #1 Hold Cycle END 选择预变性保温 循环内第一步温度和时间 Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s 预变性温度和时间 Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR 循环参数设置 Step #194.0C Hold 0m30s 循环内步骤数 * * 生物化学实验技术 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ Mullis的PCR构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 耐热DNA聚合酶 Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。 PCR反应循环 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 变性 退火 延伸 PCR的指数扩增（2n） 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 变性、退火 延伸 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：DNA 引物：P1 +P2 DNA聚合酶：TaqE 原料：dNTP 反应缓冲液10xBuffer 辅助因子：Mg2+ 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 30-60秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形