新西兰红鹿鹿茸多肽的纯化及活性研究.doc

新西兰红鹿鹿茸多肽的纯化及活性研究 王少军 论文摘要 本文作者通过酸水提醇沉法结合现代生物化学技术，从新西兰红鹿鹿茸中提取出多肽类成分；利用sephadex G-50凝胶过滤层析、反相高效液相色谱层析等作为分离、纯化手段，得到纯度较高的鹿茸多肽；以体外表皮细胞培养技术和3H-TdR掺入法对其生物活性进行探讨，初步证明该成分具有一定促进大鼠乳鼠表皮细胞增殖作用。 关键词： 新西兰红鹿 鹿茸多肽 纯化 活性 鹿茸是鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（C．elaphus L．）雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。作为一种传统名贵中药，迄今已有二千多年的应用历史。《神农本草经》中记载鹿茸“味甘，性温，主漏下恶血，寒热惊痫，益气强志，生齿不老”。现代药理研究表明，鹿茸具有提高机体免疫力，强化学习和记忆、增进性功能、强心、降压、抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎症等作用（1）。 人们在养鹿过程中发现，鹿茸的生长异常迅速，可达2~3cm/d。基于这一生物学特性，有人推测鹿茸中可能存在促进骨和上皮细胞快速生长的生物活性物质，而且，这种物质应该是鹿茸所特有的。然而长期以来，一直未能找到这种活性成分。已发现的氨基酸、多胺、核酸、酯类、性激素、芳香性类化合物都不能充分解释鹿茸的这种生理活性。近年来，人们将研究的重点转移到鹿茸中多肽类成分上，并已取得了突破性的进展。江润祥（2）等报道，从梅花鹿的鹿茸表皮层中分离出表皮生长因子（EGF），能明显促进表皮层的增殖，阐明了鹿茸表皮既是EGF的合成组织，同时也是EGF的靶组织。霍玉书（3）等从梅花鹿冻干鲜茸中，得到分子量在一万以上的多肽类物质，应用细胞调控因子活性的测定方法，发现该物质具有神经生长因子（NGFS）样作用。新西兰学者利用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）技术证明，在鹿茸顶部非骨化部位至少存在四种骨生长因子的mRNA，这些生长因子可能是鹿茸特有的生物活性物质。最近，王本祥教授从梅花鹿茸中分离出具有很强的促进骨和软骨细胞以及上皮细胞增殖的低分子量活性多肽——鹿茸生长因子，并且根据这一成果开发出国家二类新药鹿茸生长素。上述研究表明，鹿茸多肽是一个天然的细胞生长因子群，它们是支持鹿茸快速生长的生物化学基础。 新西兰红鹿（Cervus elaphus Scoticus）系中国马鹿的一个亚种，其成品性状和化学成分与我国生产的马鹿茸基本一致（4）。在长春中医学院新药研究中心刘永强老师的指导和参与下，我们对新西兰红鹿鹿茸多肽进行了提取、分离和纯化，并对其生物活性做了初步的探讨。 实验材料 药品与试剂 鹿茸为新西兰红鹿的三岔带血鲜茸，由新西兰提供，无菌锯茸后，用干冰速冻保鲜，送至本实验室备用。 流动相：异丙醇（北京化工厂，批号：980804），三氟乙酸（瑞典，批号：131198），超纯水由本实验室提供。 Dispase酶和胰蛋白酶均由Difco公司提供。3H—TdR试剂由中国科学院原子能研究所同位素所提供。PBS及D—Hanks缓冲液由本实验室配制。 1640培养液配制：10.4g1640（美国Sigma公司），加去离子水950ml，搅拌10min，加入碳酸氢钠2.0g，青、链霉素各1ml（10万u/ml），用HC1或NaOH调PH7.3~7.4，超纯水配成1000ml，湿热灭菌。 以上化学试剂均为分析醇。 2 实验动物 Wistar种大白鼠出生24hr以内的乳鼠，购自吉林省药检所动物室，合格证号：960101032 3 主要仪器 LC—8A高效液相色谱仪（日本岛津公司） FD3冷冻干燥机（丹麦） J—25高速冷冻离心机（美国Beckman公司） JMS—80胶体磨（廊坊通用机械厂） 二氧化碳孵箱（美国REVCO公司） 超滤器，纯水器（美国Millipore公司） 倒置显微镜（日本） LS—9800液体闪烁谱仪（美国Beckman公司） 实验方法 提取 取鲜鹿茸0.45kg，切成1cm3小块，用4℃蒸馏水冲洗至无血色，粉碎，胶体磨匀浆，加入5000ml冰醋酸水溶液，4℃下浸泡3hr；匀浆液离心（8000rpm,20min），取上清液，加入95%乙醇至一定浓度，静置2hr；离心，取上清液，50℃水浴中旋转蒸发回收乙醇，过滤，滤液用3KD膜超滤，冻干，最后得A（分子量大于3000）和B（分子量小于3000）两个组分。 2 分离、纯化 2.1 Sephadex G—50凝胶过滤层析 取分子量大于3KD部分粗提物1g，上G—50凝胶柱（26×100cm；预先以PH4.5，0.1mol/L甲酸——甲酸铵缓冲液平衡），以平衡缓冲液洗脱，流速为1ml/min；收集并测定各峰蛋白质浓度及活性，活性峰冻干。 2.2 反相高效液相色谱层析