利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子RNAi表达载体.doc

利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子RNAi表达载体 　　[摘要]NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。 [关键词]RNAi； Gateway载体； BP和LR反应 Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。 与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。Gateway技术可以在任何选择的系统：细菌、酵母、昆虫或哺乳动物等[3-7]进行基因的功能表达分析。现在的多点Gateway技术[8]，能够将一个或多个基因克隆到蛋白表达载体，这项强大的体外重组技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，且同时克隆效率高达95%或更高。当基因在重组目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，同时，Gateway也有助于进行带有不同标签蛋白的表达和纯化，见图1。 NAC是高等植物中特有的一类转录因子，自20世纪90年代从矮牵牛分离第1个NAC基因后[9]。拟南芥中已发现109个NAC转录因子，水稻中有75个NAC[10]。NAC蛋白根据N端保守序将NAC蛋白分为两大类（Ⅰ，Ⅱ），各包含14和4个亚类[11]。NAC转录因子参与植物生长发育的调控，如花器官的发育、侧根的形成、木质部次生壁的形成以及叶片衰老等，同时NAC还参与生物胁迫和非生物胁迫。 本项工作设计带有attB位点（CACC）的引物，利用PCR扩增目的基因SmNAC1片断，以pENTR/SD/D-TOPO为入门载体，进行BP重组反应，形成带有目的基因片断的入门载体，经PCR检测，测序鉴定正确后，在LR Clonase酶作用下，将BP重组反应的克隆产物与表达载体pK7GWIWG2D，进行LR重组反应，最终得到含目的基因SmNAC1的RNAi植物表达载体。通过使用Gateway技术，简单、快捷、准确的构建成功丹参转录因子SmNAC1的RNAi表达载体。 1材料 丹参Salvia miltiorrhiza Bunge植株；pENTR Directional TOPO Cloning Kits，Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix，Gateway载体pK7GWIWG2D均购于Invitrogen公司；大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司；Phusion超保真聚合酶购自NEB公司；质粒提取试剂盒购自上海生工生物公司；ExTaq酶购自大连宝生物工程有限公司；卡那霉素、壮观霉素购自Amresco公司；所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。 2方法 2.1SmNAC1基因RNAi片段的PCR扩增 利用DNAman软件设计NAC基因的特异性RNAi片段，根据Gateway载体构建的要求，引物5′末端要加上CACC，NACi-F：CACCATTTTCTCGAATTGAATGATT TGGGCCC；NACi-R：CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTTACG。使用Phusion超保真酶PCR扩增反应程序：98 ℃预变性30 s，然后进行35个循环：98 ℃ 30 s， 57 ℃ 30