拆分获得R-酮基布洛芬酯酶基因的筛选克隆与表达.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１０）：１６ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究报告 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 拆分获得（Ｒ）酮基布洛芬酯酶基因 的筛选、克隆与表达 刘瑞恩　赵运英　史斐斐　赵玉红　许丽娟　张金红 （南开大学生命科学学院　天津　３０００７１） 摘要　以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＮＫ１３为材料，通过构建其基因文库，筛选得到一个阳性克隆重组子ｐＵＣ１８ＮＫＨＹＤ３。 分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的７４１ｂｐ的开放阅读框，其编码的蛋白中含有酯酶 的ＧＸＳＸＧ保守序列。经在ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ系统中比对，证明该酯酶基因属于首次发现（ＧｅｎＢａｎｋ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒ：ＧＵ１４３５５２）。将酯酶基因克隆到载体 ｐＥＴ２１ｂ（＋）中，转化 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导后在宿主菌得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为２８ ｋＤａ。ＴＬＣ和ＨＰＬＣ检测结果显示，该酯酶优先水解（Ｒ）型底物，在重组菌菌液体系，转化率为 １５％时，酯酶拆分获得（Ｒ）酮基布洛芬的过量值（ｅ．ｅ．％）最高，达６２．７４％；改用重组菌湿菌体的 ＰＢＳ体系后，在转化率为１０％～５０％时，酯酶拆分获得（Ｒ）酮基布洛芬的过量值（ｅ．ｅ．％）一直保 持在７３％～７６％之间。 关键词　（Ｒ）酮基布洛芬　酯酶　不对称拆分　克隆　表达 中图分类号　Ｑ７８５　Ｑ７８６ 　　酮基布洛芬是２芳基丙酸类药物家族的主要成员 获得光学纯的单一对映体。利用微生物中酶的立体选 之一。它是一种非常重要的非甾体消炎镇痛药。临床 择性可以制备２芳基丙酸类药物的单一对映体，该方 上用于治疗慢性类风湿性关节炎、变形性关节炎、外伤 法具有立体选择性强、拆分效率高、生产条件温和、无 ［４５］ 和术后疼痛等。其 α位有一手性碳原子，所以存在一 环境污染等优点 ，因此具有良好的应用前景。目前 对光学对映体———（Ｓ）构型和（Ｒ）构型。其（Ｓ）对映 为止，利用微生物酶法拆分获得光学纯酮基布洛芬的 ［６７］ 体的抗炎镇痛作用与２倍量的外消旋酮基布洛芬相 研究报道多集中于（Ｓ）构型 ，但对于优先选择拆分 ［１］ （Ｒ）酮基布洛芬的酶报道较少。 同，而（Ｒ）对映体的抗炎镇痛作用很低 。但与其他 ２芳基丙酸类药物不同的是其（Ｒ）对映体也具有药用 　　本实验室前期自筛选出一株具有一定不对称转化外 ［２］ 消旋酮基布洛芬氯乙酯生成（Ｓ）酮基布洛芬能力的野生 价值，它对牙周病的骨质疏松有治疗作用 。（Ｒ）酮 基布洛芬在抗触觉性异常疼痛方面也发挥着重要作 菌ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＮＫ１３［在２４ｈ时转化率约为４０％， 用，其机理不涉及对环氧化酶（ＣＯＸ）的抑制，而是一种 得到的（Ｓ）酮基布洛芬ｅ．ｅ．％最高，仅为５．８４％］。前期 ［３］ ［８］ 与（Ｓ）对映体不同的机制 。 研究表明 ，ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＮＫ１３中含有几种能够选 　　为了提高酮基布洛芬的疗效需要将外消旋体拆分 择性拆分外消