氨基酸突变对细胞色素P450BM-3羟基化吲哚能力-高校化学工程学报.PDF

第22 卷第2 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.2 Vol.22 2008 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr . 2008 文章编号：1003-9015(2008)02-0282-06 氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响 1,3 1,2 1 李红梅 , 梅乐和 , 高舜晔 (1. 浙江大学化学工程与生物工程系, 浙江 杭州 310027; 2. 浙江大学 宁波理工学院, 浙江 宁波 315100; 3. 上海理工大学 食品与生物技术研究所, 上海 200093) 摘 要：利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3 (A74G/ F87V/L188Q)(PT) 的168和435氨基酸位点分别进行随机 突变，根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670 nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选，获得了三个高于亲本酶(PT) 的突变 酶D168H 、D168L和E435T 。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH 以及区域专一性的变 化情况，发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高，其中突变酶 D168H 的kcat值比亲本酶提高了3倍多；突变酶D168H 的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍，而突变酶D168L和E435T 的电子耦合率却有轻微的提高；所有突变酶均在pH 8.2 附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力；突变酶D168H对 吲哚的区域选择性得到了提高，主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93% 。另外，热稳定性实验表明：尽管突变酶D168H 和D168L 的热稳定性较亲本酶有所降低，但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为 了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息，同时为进一步定向进化P450 BM-3提高其功能特性提供了 进化模板。 关键词：细胞色素P450 BM-3 ；饱和定点突变；羟基化吲哚；靛蓝 中图分类号：TQ962.2 ；Q559.9 文献标识码: A Amino Acid Mutation Effect on Indole-Hydroxylating Ability of Cytochrome P450 BM-3 LI Hong-mei1,3, MEI Le-he1,2, GAO Shun-ye1 (1.Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China; 2.Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, China; 3.Institution of Food Science and Biotechnology, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China) Abstract: The triple mutant of cytochrome P450 BM-3 (A74G/F87V/L188Q) was demonstra