聚合酶链反应技术及其应用-黑龙江八一农垦大学.PDF

一 }t 第 8卷 第 1期 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 撮 8(1)；109~115 1995年6月 JournalofHAFLRU June 1995 聚合酶链反应技术及其应用 李 景 鹏 (东北农业大学生物工程系 哈尔滨 lsoo39) 摘要 本文叙述 7PCR技术发明、基本原理、连展和 应 用。简要地介绍了描 式、巢 式，反 响、不对称、逆转录、半定量、竞争性、散布重复序列、高变I生·引物、等住特异性、 竞争 {1 物 、多重、着邑互补 以厦免疫PCR技 术种等 同时也记述 了PCR~~术应 用于梭酸 研究 序 列分析 检测基因表达 从基因文库 中放大特定序列，研究未,~DNA片段 构建基因 图谱、 进化分斩、丧病诊断和分析生特学证据等许 领城。指 出，PCR技 术必将 成 为常用的研究 和 检测技 术之一 。 美键词 嚣盆域 厘：星卫旦 中文分类号 g55、 1 摄述 1．1 聚合酶链反应 (FCR)技术，早 在1971年，kleppe就设想用这种方法在 体 外 扩 增DNA，由于 对 DNA变性 时温度较高，加入的DNA聚台酶很快失活，必须每扩增一个循 环朴加一次酶 难于实际应 用。1976年chien从嗜热水生 茵 (Thermusaquaulcus)申分 … r o1 离 出热稳定的多聚酶 ’ ，使这种技术成为一种有实际意义的方法。1983年Mallis 正 式确定了体外扩增DNA技术，1987年获专利，称之为Polymerasechainkeaction，PCR 技术。1989年世界上称为PCR年 ，一年发表有关文章千余篇，我国1991年召开首次PCR研 讨会，有论文上百篇。现在PCR在我国已广泛用于科研，医学I临床诊断 。 1．2 PCR技术关键是引物和Taq酶。两个 引物要 求与欲扩增DNA片段两条链3端互 褂 。机理是，在高温下模板DNA双链变性成二条单链，低温时引物 和二条变性模板在互补 区复性，中温条件下在引物3端 以靶DNA为 模 板 合 成 互扑链。每经过一次这样的循环， DNA数量增加一倍，一般扩增30循环，DNA分子就 扩增到10e个，扩增长度可达lokb。扩 增循环如果超过35次，由于酶活性降低，扩增产物增加，其它副产物也急尉积累，以及其它 周素影响，产生平台效应。这时再反应下去，效率急剧下降，非特异性产物增加，对扩增不 刺 。由于Taq酶度没有3一5的外切活动，容易发生硷基错配而不能校正 L4J，有 2~10’· 差 误，4 ×1O硷‘基引起一个框架漂移。所 以，用PCR扩增的DNA片段，用于分子克陛或其 它研究时要慎重，作 以标记，以免发生谬误。 l994—1O—O列瞳稿 ， I10 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 1995tg 2 其它PCR技术 随着应用于不 同 目的，PCR技术桁化 出许多不 同方法 ，下面作简单介绍。 2． 1 锚式PCR rr 1 锚式PCR (AnchoredPCR)是Loh 等设计的技术，用于扩增r8T细胞的抗原受体 (TOR) 。TCR基因由V— J—C送片段组成，一般 J—C 片 段 编 码肤段较稳定，届 已 知，根据 J医设计出第一个引物。g~mRNA为模板合成出CDNA第一链，再用末端转移酶， 使其3端加上PolG尾 巴．以舅聚PalyC为第二引物，按常规 方 法扩增出多变的V区基因。 r^ 1 用锸式PCR可 以扩增一端 已知 ．一端未知 的DNA片段 J。 2．2 巢 式PCR r■ 1