第七章 工业微生物诱变育种.pptVIP

抗药性突变株的筛选 产量突变株的筛选 春日霉素生产菌的筛选——琼脂块培养法 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10%以上。 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟） 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养4~6小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀 （二）淘汰野生型菌株 淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩 ，以利于检出。 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去 方法： 差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。 将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发不被杀死。 * 抗生素法： 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。 原理：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。 * 抗生素淘汰野生型的方法和步骤： （1）将诱变处理后的菌体用完全培养液振荡培养2—3代以结束表型延迟现象，达到稳定的表型和生理状况。 （2）饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养4-6小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”； （3）加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。 （4）取样分别涂布MM和CM平板，菌落数差异大的浓缩效果较好 制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。 注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质使其生长繁殖，最终也被青霉素破坏，造成缺陷型筛选率大为下降。 菌丝过滤法：适用于丝状真菌 将诱变后的孢子接种至MM中，控制培养时间，使野生型长成菌丝体，通过过滤而除去菌丝体，反复几次后，剩余的多为缺陷型孢子。 * 饥饿法 原理：微生物的某些缺陷型菌株在某些培养条件下会因代谢不平衡自行死亡，可是如果在细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会因代谢平衡的恢复而避免死亡，从而双重缺陷型突变株可被浓缩。 举例： 1）胸腺嘧啶缺陷型细菌在不加胸腺嘧啶时在短时间内细胞大量死亡。而残留下来的细菌中可以发现许多营养缺陷型。 2）二氨基庚二酸缺陷型：二氨基庚二酸是合成赖氨酸和细胞壁物质的前体。这一缺陷型在不加赖氨酸的情况下不生长也不死亡。给以赖氨酸时反而大量死亡。如果细胞中发生了另一个氨基酸缺陷型突变，它反而可以存活。 该方法用于在某些条件下浓缩双缺突变株。 * （三）营养缺陷型的检出 限量补充法 MM+0.01%蛋白胨：野生型菌落大，缺陷型菌落小 ，此为限量法。如果要筛选特定的营养缺陷型，可以在MM中加入少量的这种单一生长因子，此为补充法。 夹层培养法 制备琼脂平板： 培养：长出菌落后作记号 加第四层培养基：CM 培养：新长出的菌落多为缺陷型。 * 夹层平板的制备 MM MM+菌液 MM CM 野生型 缺陷型 形态突变型 负突变型 正突变型 X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关系 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系 五、诱变剂的处理方式 单一诱变剂处理; 复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！) 1- 对照； 2-乙烯亚胺（浓度1:7000）； 3, 5, 7, 9-紫外线； 4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线 紫外线的剂量（erg/mm2）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000 乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果 诱变育种中，诱变处理的方式有多种，常用的有下面几种方式： 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株； 生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。 六、影响突变率的因素 （一）菌种遗传特性不同 （二）菌体细胞壁结构 （三）环境条件的影响 1.诱变前预培养和诱变后培养 2.温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响 3.平皿密度效应 前培养的目的： 对数中后期：生长旺盛，