益气健脾中药对脾气虚大鼠神经肽Y、血管活性肠肽与丝裂原活化蛋白激酶14基因表达影响.docVIP

益气健脾中药对脾气虚大鼠神经肽Y、血管活性肠肽与丝裂原活化蛋白激酶14基因表达影响 　　摘要：目的 观察脾气虚大鼠血清、小肠神经肽Y（NPY）和血管活性肠肽（VIP）含量，小肠组织丝裂原活化蛋白激酶14（Mapk14）mRNA表达的变化及益气健脾中药的干预效应，以揭示脾气虚证发生的内在机制。方法 受试动物随机分为空白组、模型组（7、14、21 d组）、益气健脾组，每组10只。除空白组外，其余各组采用大黄法、力竭法及饥饿法复合法建立脾气虚证大鼠模型，造模同时益气健脾组每日给予四君子汤20 g/kg干预21 d，各组大鼠分时段采用放免法测定小肠、血清NPY和VIP含量，采用实时荧光定量PCR检测小肠组织Mapk14 mRNA表达水平。结果 与空白组比较，模型组大鼠血清及小肠组织NPY含量降低（P 　　反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，冰上放置5 min以上；加入逆转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃ 15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。 引物设计：从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司[宝生物工程（大连）有限公司]设计和合成目标基因引物。见表1。 实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、8次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s，95 ℃。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量=2-ΔΔCt。 3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用―x±s表示，组间样本均数差异比较用F检验，F检验差异有统计学意义时，再用q检验进行两两比较。P0.05）。见表3。 4.4 丝裂原活化蛋白激酶14实验样品扩增曲线与融解曲线 通过融解曲线得知，扩增具有特异性。见图1、图2。 4.5 益气健脾中药对脾气虚证大鼠小肠丝裂原活化蛋白激酶14 mRNA的影响 与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠小肠Mapk14 mRNA相对表达量升高，以模型21 d组最为显著（P 　　MAPK信号途径存在于所有生物体内的大多数细胞内，是真核生物细胞重要的信号转导通路，可将细胞表面信号刺激转导至细胞及其核内，与细胞增殖、存活、分化、凋亡等生理过程密切相关[13]，其中Mapk14属于“应激诱导”的MAPK，激活的Mapk14能通过激活内源性通路，使下游c-myc表达增强，诱导bax转位，亦可增强肿瘤坏死因子-α表达，诱导细胞生理功能紊乱和细胞凋亡[14]。 本研究结果显示：与空白组比较，模型各组大鼠血清、小肠NPY含量降低，且以模型14 d、21 d组显著（P0.05）。本研究结果初步表明脾气虚病程中不但存在胃肠激素分泌紊乱，且可能与MAPK信号通路中Mapk14“应激诱导”和异常表达有关，且提示益气健脾中药（四君子汤）具有调节NPY、VIP正常分泌和抑制Mapk14异常表达的作用。 参考文献： [1] 宋红，郑小伟，王颖，等.加味黄芪建中汤对脾气虚证大鼠胃泌素基因表达的影响[J].中华中医药杂志，2008，23（2）：121-124. [2] 周正，朱云祥，李强，等.MAPK信号转导通路中ERK、JNK 和p38在大鼠肝脏缺血再灌注和缺血后处理中表达的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（15）：2919-2922. [3] Zhou Y， Wang Q， Mark Evers B， et al. Oxidative stress-indu